双斑东方鲀精子冷冻保存方法探究

尤颖哲

(漳州市水产技术推广站，福建 漳州 363000)

双斑东方鲀精子冷冻保存方法探究

尤颖哲

(漳州市水产技术推广站，福建 漳州 363000)

双斑东方鲀(Takifugubimaculatus)在福建已形成较大规模的养殖产业，但其精卵成熟同步率低、自然交配受精率低等繁殖特点已成为养殖规模化发展的最大制约因素。而精子超低温冷冻保存技术作为直接保存细胞遗传物质的一种有效方法，为双斑东方鲀规模化人工繁育问题的解决提供了方案。研究以复苏后的精子活力为选择指标，开展双斑东方鲀精子冷冻保存方法的研究，对抗冻剂、基础液、精子稀释浓度和降温程序等几个关键影响因素进行了筛选，获得了双斑东方鲀精子的最适冷冻方法：以含5%二甲亚砜(DMSO)的MPRS溶液与精子按1∶1比例稀释，样品在4 ℃冰箱中平衡30 min，液氮上方 10 cm 处熏蒸 5 min，再下降到5 cm处熏蒸5 min，之后投入液氮。按此方法保存的双斑东方鲀精子在解冻激活后，其活力可达(83 ± 3)%，与相应卵子受精，可得到平均70%的孵化率，可以满足双斑东方鲀规模化人工繁育的需求。研究结果也可为其他东方鲀鱼类的相关研究提供参考。

双斑东方鲀；精子；冷冻保存；繁育

水产经济物种的良种选育和种质保护对水产养殖业的健康发展至关重要。利用低温生物学技术可为重要养殖鱼类的种质保护、良种选育及提供充足的育种研究材料提供巨大的帮助[1]。其中，鱼类精子由于体积小、抗冻剂容易通过、冷冻保存较易成功，已成为解决鱼类种质资源及遗传多样性保护的有效方法之一。1953年，英国科学家首次用干冰冷冻保存了大西洋鲱精子，解冻后获得了80 %的受精率[2]。此后，国内外开展了多种鱼类的精子冷冻保存研究工作，如石斑鱼[3-6]、石首鱼[7-9]、鲆鲽鱼类[10-12]等，并已取得很大进展。

双斑东方鲀(Takifugubimaculatus)属鲀形目、东方鲀科、东方鲀属，为近海暖温性底层鱼类，仅分布于中国南海、东海和黄海南部[13]。双斑东方鲀肉鲜嫩可口、营养价值高，具有极高的食用和医用价值[14]。双斑东方鲀养殖在福建已形成较大规模的产业，是福建省东方鲀养殖中仅有的两个品种之一，年养殖总产量约5 000 t，其鱼肉还被加工成烤鱼片，产量占全国总产量的90%以上[15]。虽然双斑东方鲀市场需求巨大、前景广阔，但其规模化繁育存在着雌雄成熟不同步、自然交配受精率低等条件限制。目前，人工授精已成为双斑东方鲀人工繁育的主要手段，而利用低温冷冻技术可以保证在人工授精时获得充足的鱼类精子供应，使规模化繁育得以顺利实现，进而保障其产业的可持续健康发展。此外，对双斑东方鲀开展精子冷冻保存技术研究，还可以为已日渐衰竭的野生资源量的保护和复壮提供必要的帮助。

1 材料和方法

1.1 实验材料

双斑东方鲀亲鱼为野生2龄鱼，购自浙江省台州市三门县，体质量350～400 g，暂养于福建省漳浦县前亭兴海水产养殖场。2016年4月，采用轻挤压鱼体腹部的方法从性成熟的雄性亲鱼采精，无污染的精液暂存于 4 ℃冰箱。在显微镜下用细胞计数板统计被盐度28 灭菌海水激活的精子占总精子的比例，该比例即代表精子的活力，选用活力90 %以上的精液用于实验。实验所用鲜精的活力平均为 93 %，精子寿命平均为 40.5 s。

1.2 抗冻剂的筛选

选用甘油和二甲亚砜(DMSO)这两种常见渗透性抗冻剂来检测其对双斑东方鲀精子的保护效果，并选用最常见的鱼类冻精稀释液Hank’s液作为抗冻剂筛选过程的基础稀释液[16]。按表 1配制3种常见的精子冷冻保护稀释液Hank’s[16]、MPRS[17]和Cortland[18]。

表1 3种精子稀释液基础溶液的组成成分

按表1配制基础溶液 Hank’s液，分别以4个浓度梯度(5 %、10 %、15 %和20 %)添加甘油或DMSO至稀释液，配成8种精子冷冻保存液，并置于1.5 mL冻存管中。将精液与配制好的保存液以 1∶1 的比例混合，精子冻存混匀液的总体积为100 μL，每组实验设3个平行样。将装有精子冻存混匀液的冻存管以4°C 冰箱平衡 30 min，液氮上方10 cm处熏蒸10 min，再投入液氮进行降温(表2，Y3)。复温时直接放入 38 ℃水浴中快速解冻至完全融化，取少许用盐度为 28 的灭菌海水激活，记录冻精激活后的活力。

表2 降温程序列表

1.3 精子稀释比例的筛选

以含 5% DMSO的 Hank’s 液为精子冷冻保存液，将双斑东方鲀精子分别以 1∶1、1∶2、1∶5、1∶7、1∶10 的比例稀释，总体积保持100 μL，每组实验设3个平行样。冻存管的降温、复温步骤同1.2节。

1.4 基础溶液的筛选

按表1配制的Hank’s、MPRS和Cortland液中，分别加入DMSO至终浓度5%。精子与冷冻保存液稀释比例为1∶1，总体积100 μL，每组实验设3个平行样。冻存管的样品降温、复温同1.2节。

1.5 降温程序的筛选

以1.2、1.3和1.4的实验结果为基础，以终浓度5 % DMSO的MPRS作为精子冷冻保护稀释液，精子与冷冻保存液稀释比例为1∶1，评估不同降温步骤对双斑东方鲀精子冷冻保存活力的影响。每组实验设3个平行样，按4℃冰箱平衡、液氮上方熏蒸、直接投入液氮这3个步骤的不同，分为4种程序(表2)分别进行降温。冻存管的样品复温同1.2节。

1.6 冻精受精实验

选择1.5节实验中Y4冷冻保存程序下的双斑东方鲀精子(最高精子活力)。取3管冷冻5 h的精子复温，同时取 300 μL 鲜精作为对照。量取6份各4 mL新鲜卵子，分别与6份精子混合，加入海水激活 10 min后洗卵两遍，23 ℃海水中孵化受精卵，孵化 7 d后统计孵化率。

1.7 数据处理方法

使用统计软件SPSS17.0和EXCEL进行数据统计分析，利用方差分析(One-wayANOVA)来检验精子冷冻前后活性差异的显著性，并利用EXCEL软件对分析所得数据做柱状图和对比表格。

2 结果

2.1 抗冻剂的筛选结果

实验分别以不同浓度的DMSO 和甘油这两种溶剂作为抗冻剂进行超低温保存双斑东方鲀精子，通过解冻并检测精子活力来确定抗冻剂的保护效果，其结果见表 3。从表3可看出，甘油对双斑东方鲀的精子基本无抗冻保护作用。而随着 DMSO 浓度由5%增加到 20%，精子活力和寿命都显著降低(P<0.05)。以5%DMSO作为抗冻剂，其解冻精子的活力平均69 %，显著低于鲜精(93 %)的活力(P<0.05)，而激活后精子的寿命则无显著差异(P>0.05)。

表3 不同浓度的两种抗冻剂对精子超低温保存的效果

2.2 精子稀释比例的筛选结果

在冷冻保存过程中，精子浓稠度对于平衡精子细胞的内外渗透压有重要的影响，因此，稀释比例是影响精子活力的重要因素。精子冷冻前经以下倍数稀释，复温后活力结果如图1所示。由激活结果可看出，随着稀释比例由 1∶1扩大到1∶10，精子活力呈下降趋势，按1∶1比例稀释的精子活力最高(70%)。因此，双斑东方鲀精子超低温保存时，按 1∶1比例稀释可取得最好效果。

图1 不同稀释比例对精子活力的影响

2.3 基础液的筛选结果

由于不同鱼类精子对环境适应能力及代谢水平上的差异，对提供保护的稀释液成分要求也会有所不同。因此，本实验选用3种常见的基础稀释液来检测其对双斑东方鲀精子冷冻保存的效果。在抗冻剂均为5%DMSO的条件下，MPRS液、Hank's液和Cortland液对冻精解冻后活力的影响分别是(77±3)%、(62±1)%和(75±3)%，对精子寿命的影响分别是(43.7±2.1)s、(40.1±0.9)s和(24.5±0.2)s。Hank's的活力最低(P<0.05)，而 Cortland 液作为基础液保存的精子寿命最短(P<0.05)。综合活力和精子寿命这两个指标，MPRS 液是最适合双斑东方鲀精子超低温保存的基础稀释液。

2.4 降温程序的筛选结果

不同的生物样品对降温速率同样有不同的要求[1]。本次实验比较了4种不同降温程序下的精子活力，复温激活后的活力显示，在基础液和抗冻剂浓度分别为MPRS、5%DMSO 时，Y1、Y2、Y3、Y4降温程序对双斑东方鲀精子冷冻后的活力的影响分别为(3±1)%、(16±1)%、(71±4)%、(83±3)%。

4种降温程序中，Y1直接投入液氮，而其余3种降温程序都在4℃冰箱平衡30 min。结果证明，经过 Y1 降温程序冷冻的精子活力极低，Y4 精子活力最高，而Y3 的活力也极显著高于Y2(P<0.01)，这说明双斑东方鲀精子的超低温冷冻需要经过一定的降温平衡，而且循序渐进的降温模式最适合用于双斑东方鲀精子的超低温冷冻保存。

2.5 冻精受精实验

为了确定冷冻精子复苏后的受精能力，使用之前结果获得的最佳保存方案(5 % DMSO的MPRS，稀释比例1∶1，Y4降温程序)下的冷冻精子低温保存5 h后复温，取等量冻精和鲜精，分别与等量卵子受精。孵化 7 d后，计算孵化率，结果显示，组别鲜精1、鲜精2和鲜精3的孵化率分别是83.5%、71.2%和85.4%，冻精1、冻精2和冻精3的孵化率分别是68.8%、65.7%和75.8%。虽然冻精孵化率平均约70 %，略低于鲜精孵化率(80%)，但已足以满足双斑东方鲀的规模化人工繁育所需，也高于七带石斑鱼[19]、史氏鲟[20]等鱼类冻精复苏后的孵化率。

3 讨论

3.1 基础液和抗冻剂对精子超低温冷冻保存的影响

基础液能提供精子所需的合适渗透压环境，在有关鱼类精子冷冻保存的研究中，基础液大部分是无机盐溶液，能为精子提供一个合适的生存环境，防止精子在体外被激活，延长其在鱼体外的存活时间。Hank’s、MPRS和Cortland溶液是常用的动物精子冷冻保存基础液。本研究结果表明，MPRS是最适合双斑东方鲀精子冷冻保存的基础稀释液。抗冻剂在精子的冷冻过程中能保护精子细胞免受冰晶损伤，并有调节细胞渗透压的作用，是影响精子冷冻保存的重要因素[1]。DMSO和甘油在鱼类的精液冷冻保存中均有广泛应用。DMSO在棕点石斑鱼[5]、大黄鱼[8]、大菱鲆[12]等被证明是适合的抗冻剂，而甘油在淡水鱼类的精液冷冻保存中也取得了理想的效果[21]。在本实验中，甘油无论在何种浓度下，均未能起到丝毫的保护作用，可见甘油并不适合作为双斑东方鲀精子的抗冻剂，而DMSO 则显示出了较好的适用性，其中5%的终浓度可以获得最佳的精子复苏活力，而随着DMSO浓度的增加，精子复苏活力显著下降。

3.2 降温程序与精子活力的关系

降温程序对超低温冷冻精子的存活率和活力有重大影响[22]。最佳的降温方法是将待冷冻的样品通过程序降温仪有步骤地降温。由于程序降温仪操作繁琐、设备昂贵，而鱼类精子因体积小，抗冻剂可以迅速进入细胞内，因而在实际操作中无需对降温程序要求过于精确，通常会采用简便的方法，即通过将样品放在液氮面上一定高度熏蒸的方式进行降温。本研究发现双斑东方鲀精子的超低温冷冻需要经过多次降温平衡。在4 ℃冰箱中的降温平衡步骤之后，在液氮上方不同高度进一步降温平衡，可极有效地提高冷冻精子的存活率。

3.3 稀释比例与精子活力的关系

在鱼类精子冷冻保存实验中，精液与冷冻稀释液一般以 1∶1～1∶20 的体积比稀释，都能取得很好的冷冻效果。在大菱鲆[12]精子冷冻保存中，稀释比例从1∶1至1∶9时，精子活力没有显著变化。而在大西洋石首鱼[8]的实验中，稀释比例大于1∶20后，精子存活率显著降低。本实验中，1∶1的稀释比例可以获得最高的精子活力，而在稀释比高于1∶5之后，精子的活力则显著降低。这可能是由于比例的增大，稀释精液与稀释液混合后的溶液中DMSO的相对浓度提高，导致精子活力的下降。

4 结论

经过对稀释液、抗冻剂等多个影响因素的比较分析，获得了双斑东方鲀精子冷冻保存的最佳方法：以含5 % DMSO的 MPRS 溶液与精子按 1∶1 比例稀释，4°C 冰箱中平衡30 min，液氮上方 10 cm处熏蒸 5 min，下降到5 cm处再熏蒸5 min，之后投入液氮。此方法可获得高达83 %的冻融精子活力，基本接近鲜精的活力水平。此方法的建立，不仅可以为双斑东方鲀规模化人工繁育提供充足的可激活精子，保证双斑东方鲀产业可持续发展，而且可以为其他东方鲀鱼类的相关研究提供参考，同时也进一步丰富了我国鱼类精子库种类，为双斑东方鲀种质资源的保护提供技术支持。

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·文摘·

标志的外科式植入对虹鳟的短期影响

外科式植入标志提供了生物遥感数据和生物跟踪记录数据，这些数据可用于调查鱼类在自然环境中的行为和生理机能。然而，为了确保数据的有效性，了解植入标志对鱼类行为和生理机能的影响是至关重要的。因此已有许多研究对标志的外科式植入产生的影响做了调研。这些研究表明，标志重量应该小于鱼体体重的2%(所谓的“2%规则”)。但种类相同但大小不同、或者所处发育阶段不同(如稚鱼或成鱼)的鱼是否适用于2%规则，相关信息几乎没有。本研究调研了虹鳟体内的植入标志和鱼体体重之比率(在此称为标志个体比)是否影响其摄食行为、存活率、血浆乳酸盐水平和生长率等问题。发现超过3%的标志个体比在植入标志后的第1天和第8天均严重损害其摄食行为；存活率与标志个体比呈负相关；鱼体体重对存活率没有影响。分析显示，5.6%的标志个体比在第8天的存活率预计为90%。在第8天，标志个体比或外科式植入不影响虹鳟的血浆乳酸盐水平和生长率。从分析中得出结论，2%规则可能是保守的，可能在稚鱼阶段及成鱼虹鳟可接受。

(《Fisheries Research》Vol.185)

Research on cryopreservation ofTakifugubimaculatusspermatozoa

YOU Yingzhe

(FisheriesTechnologyPromotionStationofZhangzhou,Zhangzhou363000,China)

Takifugu bimaculatus aquaculture industry has been largely developed in Fujian Province,however,its benign development was restricted by some of its reproductive characters like the unsynchronization of maturity of sperm and egg,and low fertility rate under nature mating conditions.Sperm cryopreservation method provides an effective solution for this restriction because it can preserve germplasm directly.In this study,the optimal parameters for sperm cryopreservation of T.bimaculatus were tested.The most suitable treatment for T.bimaculatus sperm is to dilute the sperm by MPRS solution with 5 % DMSO at a ratio of 1∶1,freeze at 4 ℃ for 30 min,fumigate at 10 cm above the surface of liquid nitrogen for 5 min and then at 5 cm above the surface of liquid nitrogen for 5 min,and finally preserve in liquid nitrogen.By this procedure,the motility of frozen-thawed sperm could reach (83±3) % and the hatching rate after artificial insemination was about 70 %,which can meet the requirement of lager scale breeding of T.bimaculatus.And our result could also be a good reference for relative researches in other fugu fishes.

Takifugubimaculatus;spermatozoa;cryopreservation;breed

10.3969/j.issn.1007-9580.2017.01.007

2016-10-30

2017-01-17

厦门南方海洋中心项目双斑东方鲀和菊黄东方鲀的三倍体规模化育苗技术开发(14GZY025NF25)

尤颖哲(1973—)，男，高级工程师，研究方向：海水水生动物繁育。E-mail:yyz197352@sina.com

S962.1

A

1007-9580(2017)01-035-05