复合菌固体发酵降解木质素的条件优化

2017-04-05文婷管维周国英

江苏农业科学 2016年12期

文婷管维++周国英

摘要：以降解率和选择系数为主要指标，采用单因素优化、均匀设计及正交设计试验，对白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）固体发酵降解竹材木质素条件进行优化。结果表明，复合菌适宜的降解条件为酒石酸铵0.2 g/L、葡萄糖 14 g/L、Ca2+0.8 mmol/L、Mn2+0.6 mmol/L、接种量6%、含水量50%、温度32 ℃、pH值5.0，固体发酵时间25 d时，竹材木质素降解率为60.29%，选择系数为12.79。

关键词：复合菌；固体发发酵；木质素；降解率；选择系数

中图分类号： S188+.4文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）12-0506-03

收稿日期：2015-10-28

基金项目：湖南省科技重大专项（编号：2011FJ1006）。

作者简介：文婷（1985—），女，湖南衡阳人，硕士，主要从事微生物选育及发酵工程研究。E-mail：282637170@qq.com。

通信作者：周国英，博士，教授，博士生导师，主要从事林业微生物研究。E-mail：gyzhou2118@163.com。

我国竹质资源丰富，竹纤维具有绿色环保、吸湿透气、天然抗菌和抗紫外线等特性，具有极大的市场潜力和附加值。竹纤维中的木质素严重影响了竹纤维产业化开发进程，而微生物降解木质素是解决这一问题的有效途径之一。因此，本研究以木质素降解率和选择系数为主要指标，采用单因素优化、均匀设计及正交试验，对白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）固体发酵降解木质素条件进行优化，从而提高木质素的降解率和选择专一性，为实现微生物固体发酵降解竹材木质素产业化打下基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源

白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）由中南林业科技大学微生物学实验室分离、筛选并保藏。

1.1.2试剂与培养基

固体平板培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、pH值6、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、维生素B1 8 mg、蒸馏水1 L，于121 ℃，0.1 MPa湿热灭菌 30 min。

液体发酵培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5g、维生素B1 8 mg、蒸馏水1 L，于121 ℃，01 MPa湿热灭菌30 min。

固体发酵培养基：竹粉（40目）15.0 g、料液比1 g ∶[KG-*3]3 mL，合成培养液[1]，拌匀，于121 ℃，0.1 MPa湿热灭菌30 min。

1.1.3仪器

HZQ-C型恒温振荡器、HPS-280型生化培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；AR2140型电子天平，奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；UV-1600紫外/可见分光光度计、北京瑞利分析仪器公司。

1.2方法

1.2.1制备种子液

用打孔器取直径为8 mm的白腐菌菌落1块于液体发酵培养基中，28 ℃、装液量为400 mL/L、150 r/min 摇床培养3 d。

1.2.2固态发酵培养

将种子液按10%接种量（菌悬液浓度0.1亿CFU/mL）接种至已灭菌的固体发酵培養基中，在温度28 ℃、湿度80%的恒温箱中静置培养30 d。

1.2.3样品木质素含量的测定采用Klason法[2-3]测定木质素含量。

1.2.4样品纤维素含量的测定参考董荣莹等的方法[4]测定纤维素含量。

1.2.5木质素降解选择性系数木质素降解选择性系数=木质素降解率/纤维素降解率。

1.2.6固体发酵降解木质素培养基组分的确定

保持固体培养基其他组分不变，依次改变培基的氮源、碳源和金属离子种类，等量接种白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）菌悬液进行固体发酵。

确定最佳氮源、碳源和金属离子后，利用DPS 9.50软件进行均匀试验设计[5]。根据预试验结果及试验可行性确定考察因素范围，对筛选出的培养基组分进行优化，然后通过二次多项式逐步回归分析试验数据，建立回归方程，通过指标最大预测值确定发酵培养基各组分的适合配比，并进行试验验证。

1.2.7确定固体发酵降解木质素的培养条件

采用优化后的固体培养基，以接种量、含水量、初始pH值、培养温度、培养时间等因素为对象，通过正交试验来确定最佳的固体发酵培养条件，如表1所示。

1.2.8最佳发酵条件的验证

将白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）分别按照优化前后的降解条件进行固体发酵，分别测定竹材木质素的降解率及选择系数。

2结果与分析

2.1固体发酵降解木质素的培养基

2.1.1碳源

分别在基础培养基中添加浓度为1.0%的不同碳源，以葡萄糖为碳源时，白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）的降解能力明显优于蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉，对木质素的降解率达到了40.21%，选择性系数为5.26；以竹粉为碳源时，木质素降解率最低，为20.69%（表2），这可能是因为木质素本身并不能充当碳源[6]，自身的降解更依赖于培养基中新增加的底物碳源。因葡萄糖易于利用，既能提供菌株生长发育所需的碳源，又能提供促进菌株生长发育和降解竹材木质素所需的能量，因此选择葡萄糖为碳源。

2.1.2氮源

分别在基础培养基中添加浓度为0.5 g/L的不同氮源。由表3可见，以酒石酸铵为氮源时，发酵后木质素降解能力最高，降解率为41.91%，选择系数为6.16。这说明添加酒石酸铵时，复合菌（HY-YY-ZYS）的降解能力优于添加其他几种氮源。其中以酵母膏作氮源时，木质素降解率为3831%，略低于酒石酸铵，但明显高于其他3种氮源，且选择系数为4.36。由于酒石酸铵是木质素降解菌发酵工业中最常用的无机氮源，价格便宜，而且是合成木质素降解酶系中的重要氮源，能诱导该白腐菌种产木质素降解酶系，综合考虑效果与原料成本，因此选择酒石酸铵为氮源。

2.1.3金属离子

分别在基础培养基中添加浓度为 0.5 mmol/L 的金属离子Fe3+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+。由表4可见，Mn2+和Ca2+有利于菌种生长，对产酶有一定的促进作用，木质素降解率分别为43.58%、42.19%，大于其他金属离子，选择系数分别为7.26、6.78，均高于其他金属离子。可能由于金属离子中Mn2+是酶的辅酶或激活剂[7-8]；Ca2+能影响细胞膜的通透性，既能促进菌体的基础代谢，又能影响许多代谢产物的生物合成，因此选用Mn2+和Ca2+作为金属离子组合，添加到培养基中进行下一步优化试验。

2.1.4均匀设计法优化培养基

培养基中各组分之间有一定的内在联系，在单因素试验基础上，考察培养基中碳源、氮源及金属离子的含量对木质素降解率及选择系数的影响，以寻求培养基中各组分的最佳配比。采用4因素15水平，对筛选出的碳源、氮源及金属离子组分进行优化（表5）。

采用DPS 9.50软件，对各因素水平对木质素降解率的影响结果，進行二次多项式逐步回归分析，得到方程：y=1508-2.68x1+3.85x2+25.01x3+21.92x4+0.40x12-011x22-4.59x32-85.96x42。

相关系数r=0.928 9，F=4.861 3，P=0.035 1，剩余标准差s=2.096 2，调整后的相关系数为0.876 4，查表F0.05（4，10）=3.24，F>F0.05（4，10），回归方程显著。

根据回归方程求ymax，当x1=0.2 g/L、x2=14 g/L、x3=08 mmol/L、x4=0.6 mmol/L时，ymax=46.18，预测区间为[43.50，51.68]。根据优化条件，进行3次固体发酵降解竹材木质素试验验证，最终平均结果为46.29，选择系数为1072，试验结果均在预测范围内，且有明显提高。

2.2固体发酵降解木质素的培养条件

根据表1设计正交表，考察5个因素4个水平，找出木质素最佳降解条件（表6）。按照优化后的培养条件，将白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）按正交表所列的试验需要接种到竹材固体培养基上，然后测定木质素降解率（表7）。

由表7可见，因素C（温度）有显著性差异，5个因素对降解率的影响由大到小依次为C>D>B>E>A；由表6可见，因素C的关系为C3>C2>C1>C4，因此当温度为32 ℃时，复合菌可以达到降解木质素的最适合状态；因素D（pH值）的关系为D3>D2>D4>D1，当固体发酵初始pH值为5时，木质素降解的效果最适合；因素B（含水量）的关系为B3>B2>B4>B1，当含水量为50%时，复合菌可以达到降解木质素的最适合状态；因素E（时间）的关系为E4>E3>E2>E1，当固体发酵时间在35 d时，木质素降解率最大，由于在固体发酵30 d之后木质素降解率变化不明显，因此为了节约时间[CM（25]，选择了E2，即当发酵25 d时，木质素降解率为最适合固[CM）]

体发酵时间；而因素A（接种量）的关系为A2>A3>A4>A1，即当接种量为6%时，木质素降解率最适合。

综合分析，选择的最优组合为A2B3C3D3E2，即当复合菌（HY-YY-ZYS）在固体发酵条件为接种量6%、含水量50%、温度32 ℃、pH值5、固体发酵时间25 d时，木质素降解效率最好。

2.3最佳降解条件的验证

将复合菌（HY-YY-ZYS）按照优化前后的降解条件固体发酵，分别测定竹材木质素降解率及选择系数。结果表明，在原始条件下，白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）竹材木质素降解率为38.54%，选择系数为3.64；经过降解条件优化后，白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）竹材木质素降解率为6029%，选择系数为12.79，降解率增加了21.75百分点，选择系数增加了9.15，降解时间缩短5 d，竹材木质素降解率、选择系数，生产效率明显提高，且降低了生产成本。

3结论与讨论

白腐菌降解木质素主要是在次生代谢期间产木质素降解酶，从而达到降解木质素的作用。影响木质素降解酶生物合成的培养基成分主要因素有碳源、氮源、金属离子、初始pH值、诱导剂和表面活性剂等，为菌株营造一个有利于木质素降解酶系形成和运行的发酵环境，是生物降解木质素研究的重要内容[9-12]。本研究以降解率和选择系数为主要指标，采用单因素优化方法结合均匀设计试验，对白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）固体发酵降解竹材木质素培养基条件进行了优化：酒石酸铵0.2 g/L、葡萄糖14 g/L、Ca2+ 0.8 mmol/L、Mn2+ 0.6 mmol/L 时，降解率为46.29%，选择系数为10.72。

白腐菌固体发酵降解木质素培养条件主要因素有接种量、氧气浓度、温度、含水量等[13]。本研究以降解率和选择系数为主要指标，采用正交设计试验，对白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）固体发酵降解竹材木质素培养条件进行优化，得到最优组合为A2B3C3D3E2，即当复合菌（HY-YY-ZYS）的固体发酵条件为接种量6%、含水量50%、温度32 ℃、pH值=5，固体发酵时间25 d时，木质素降解率最高。将复合菌（HY-YY-ZYS ）分别按照优化前后的降解条件固体发酵，分别测定竹材木质素降解率及选择系数，进行最佳降解条件的验证。结果表明，在原始条件下，白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）竹材木质素降解率为38.54%，选择系数为3.64；经过降解条件优化后，白腐真菌组合（HY-YY-ZYS）竹材木质素降解率为60.29%，选择系数为12.79，降解率增加了21.75百分点，选择系数增加了9.15，降解时间缩短5 d，竹材木质素降解率、选择系数、生产效率均得到了明显提高，且降低了生产成本。

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