MALDI-TOF-IMS在生物医学中的研究进展及法医学应用展望

任冠恒 ，翁榕花 ，施 妍 ，黄 平 ，李正东 ，邵 煜 ，邓恺飞 ，刘宁国 ，陈忆九

（1.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.南方医科大学基础医学院法医学系，广东 广州 510515；3.莆田市公安局城厢分局，福建 莆田 351100）

·综 述·

MALDI-TOF-IMS在生物医学中的研究进展及法医学应用展望

任冠恒1，2，翁榕花3，施 妍1，黄 平1，李正东1，邵 煜1，邓恺飞1，刘宁国1，陈忆九1

（1.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.南方医科大学基础医学院法医学系，广东 广州 510515；3.莆田市公安局城厢分局，福建 莆田 351100）

基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱成像（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight imaging mass spectrometry，MALDI-TOF-IMS）技术通过对生物组织切片的扫描，分析切片中的未知组分，获取组织的分子成像图，已成为研究生物标志物、脂类分布、药物代谢等方面的有力手段。本文对该技术在蛋白质鉴定、临床应用、药物研发、脂类研究及脑损伤方面的应用进行了综述。

法医病理学；质谱成像；综述；基质辅助激光解吸电离

基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱成像（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight imaging mass spectrometry，MALDI-TOF-IMS）技术是一门新兴的分子成像技术，主要用于人类和动物组织切片中的蛋白质研究，特别是在病理机理研究中的应用，对法医病理学的发展前景有极大的推动作用。此外，MALDI-TOF-IMS还可用于药物研发，当药物作用于病变组织，可跟踪特定药物及其代谢物在组织中的空间分布，揭示化合物如何在不同组织中发挥作用。MALDI-TOF-IMS在脂质组学方面也有大量的研究，并取得了一定的进展。本文对该技术在蛋白质鉴定、临床应用、药物研发、脂类研究以及脑损伤方面的应用进行综述。

1 蛋白质的鉴定

鉴定组织中的差异蛋白和多肽有利于阐明基础疾病的生物学过程。通过对MALDI-TOF-IMS分析获得的原始质谱图进行加工处理和统计学分析后，得到组织中所有差异表达的质谱峰列表（按m/z排列），这些差异峰所对应的多肽和蛋白可能在疾病发展进程中起到显著的调节作用，因此，鉴定这些多肽和蛋白对于阐明法医病理学机制有非常重要的意义。而蛋白质的鉴定方法会因样品的复杂性、蛋白质丰度或分子量而不同。目前最常用的方法有两种，即自底向上策略和自顶向下策略。在自底向上策略中，纯化的蛋白质或者复杂的蛋白质混合物被酶切为肽段，随后使用色谱分离肽段混合物，并对肽段混合物进行质谱分析[1]。在自顶向下策略中，完整的蛋白质分子被作为一个整体进行质谱分析[2]。一般情况下，自顶向下策略多应用于分析相对分子质量较小的蛋白质，因为相对分子质量大于100 000的蛋白质碰撞诱导碎裂通常是不充分的。自底向上策略多用于分析复杂的样品混合物，常常需要对蛋白质水解得到的肽段混合物进行碰撞诱导碎裂，然后进行串联质谱分析。蛋白质鉴定数据处理方法可以分为三类，即数据库搜索方法、从头测序方法和肽序列标签方法。其中数据库搜索是应用最广泛的方法，一般包括三步：图谱处理、候选肽段生成和实验-理论图谱比对。数据库搜索可借助商业软件SEQUEST和MASCOT[3]来完成。

MALDI-TOF-IMS直接获得不同分子量的物质在组织切片上的分布信息，对于相对分子质量较大的蛋白，难以直接通过串联质谱法（MS/MS）分析鉴定。原位酶切技术是将酶液微滴点在组织切片上，在室温下将蛋白质在其原位酶切成若干肽段的一项新技术。该技术可通过对酶切后肽段的MS/MS分析，鉴定其所属蛋白质[4]。这种原位鉴定蛋白质的方法与传统的蛋白质分离鉴定方法相比更省时间，同时将蛋白质直接成像分析结果与相同蛋白质的多肽分布特征相比对，若两者结果一致，则表明蛋白质在酶切过程中位置未发生变化，原位酶切技术提高了蛋白质的鉴定成功率。最后，可以通过免疫组织化学等方法，采用特异的抗体对鉴定的蛋白质进行验证。发现新的生物标志物一直是广大的法医病理学者致力的方向，MALDI-TOFIMS技术的出现将为法医病理学提供一条新的思路。

2 在临床研究中的应用

医学影像技术已经成为临床诊断的必备手段，但是绝大部分不能在分子水平上提供组织成分的分布信息，而质谱成像技术能在分子水平上发现病变组织的标志物，因此在临床诊断上具有较好的应用前景。目前，MALDI-TOF-IMS已用于多种疾病的诊断，包括阿尔茨海默病[5]、人类非小细胞肺癌[6]、神经胶质瘤[7]、霍奇金淋巴瘤[8]和胃肠道的癌前病变[9]等。疾病发生过程涉及众多细胞事件，而蛋白质是众多细胞事件的执行者。任何疾病的发生发展过程蛋白质都会发生不同变化，如肿瘤在其发展过程中蛋白质发生异常变化，并涉及蛋白质表达量的增减、翻译后加工的改变等，从而导致肿瘤表达的蛋白质谱发生改变。最常用的是比较蛋白质组学的方法，找出具有显著性差异的m/z位点，鉴定出与病情发展相关联的特定蛋白质分子。在某些研究中，实验的目的是鉴定与疾病发展相关的特殊分子，如胶质瘤或非小细胞肺癌的蛋白质分子特征能用于辨别肿瘤级别并与患者的存活率关联[10]。MALDI-TOF-IMS在寻找生物标志物方面的作用已广泛应用于临床并取得不错的发展。YE等[11]展示了MALDI-TOF-IMS在临床应用中的多功能性，如生物标志物用于各种疾病的诊断、疾病严重程度的预测以及体内药物的代谢反应等。随着MALDI-TOFIMS技术的不断发展，人们将会对生物学疾病有更深刻的认识，并且在临床诊断中的应用进一步推进。通过蛋白水平的监测，不仅可以暴露疾病的类型，还能暴露疾病的严重程度，特别是发现癌前病变。MEDING等[12]利用MALDI质谱成像技术成功将六种常见的癌症探测出来，包括与巴雷特食管相关的食管癌、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌、胃癌和甲状腺癌。研究者们利用MALDI-TOF-IMS建立各种已知癌症类型的不同蛋白分子标志物的数据库，根据其蛋白质组学的差异性，将癌症细胞特定的图谱提取出来并进行分类，获得了很高的可信性。

3 在药物研发中的应用

药物研发的关键在于识别正确的药理学靶点，药物能否到达作用部位有助于研究者们更好地评定化学物作为医药产品的潜在价值和产生的毒理效应[13]。MALDI-TOF-IMS技术使直接测定组织切片上的药物分布成为可能，这也许能阐明新药开发过程中药物处置或生物转化的途径。很多化合物的相对分子质量小于1000，属于小分子化合物一类，具有生理和药理上的相关性[14]。药物研发的常用方法是将药物用放射性同位素标记，运用放射自显影技术研究受体的分布和数量。放射自显影技术是将放射性同位素标记的药物给予动物口服，然后将动物处死，将组织进行切片并放于暗盒内曝光，观察放射性药物在细胞内外分布的情况。相较于放射自显影技术，MALDI-TOF-IMS不需要使用放射性同位素标记药物，这在药物开发初期有明显的优势，因为将大量需要被筛选的药物进行放射性标记是非常耗时的工作。此外，MALDI-TOFIMS能够区分药物与其代谢物，而放射自显影技术则不能有效区分放射线是来自药物还是其代谢物。放射自显影技术另一个缺点是不能同时获得组织内药物的时间、空间分布信息，在进行剂量估算时，只能获得某一时点的剂量率。MALDI-TOF-IMS在空间分辨率达100μm下能同时测定多种药物在组织切片上的分布情况[15]。尽管MALDI-TOF-IMS一般只用于生物聚合物的分析，但将这种技术用于小分子（相对分子质量＜1 500）的定性和定量分析具有良好的潜能[16]。MALDI-TOF-IMS用于小分子的研究多见于药物活性化合物及其代谢物的分析，如有报道[17]研究药物奥氮平及其代谢物在整个大鼠切片中的分布，该研究结果与放射自显影和LC-MS/MS定量结果具有很好的相关性，展示了MALDI-TOF-IMS用于代谢物研究的可行性。

4 在脂质组学方面的应用

脂质组学是研究一个生物体内所有脂类分子的特性，以及其在蛋白质表达和基因表达调节过程中的作用，是生物标志物研究的前沿方向之一[18]。气相层析-质谱技术用于脂类的分析已经有数十年历史。气相层析分析脂类分子的首要条件是这些脂类分子必须气化，由于很多脂类分子是非挥发性的，所以化学修饰使脂类分子气化是此方法必不可少的一步。MALDI技术的发展使得脂类的质谱分析发生了巨大的改变，脂类的挥发性问题不再如以前那么突出，脂类可以直接采用MALDI电离后进入质谱仪进行MS和MS/MS分析，这使得脂类的鉴定能够快速、高通量和精确地进行并极大地推动脂质组学的研究。MALDI-TOFIMS分析法主要有两种，一种是溶剂提取法[19]，另一种是组织切片直接分析法[20]。溶剂提取法是采用简单易操作的全脂类提取方法，然后用MALDI-TOF-IMS直接进行分析。组织切片直接分析法是用MALDITOF-IMS直接分析组织样品中脂类的分布，通过对健康和疾病组织的质谱图对比分析，可以直接对其中的差异脂类进行定性鉴定。MALDI-TOF-IMS用于脂类分子的成像研究，不仅可以获得完整和精确的结构图，而且能在组织切片处理和破坏程度减到最低的情况下跟踪组织切片中脂质分子的分布。利用MALDITOF-IMS技术，研究人员已对小鼠大脑中的卵磷脂[21]、神经节糖苷[22]、硫酸酯[23]和脑苷脂类[24]等脂类分子的分布进行了研究。也有研究者[25]利用离子迁移率的方法结合MALDI-TOF-MS用于脂质分子的分离。在该技术中，首先以离子迁移率的方法分离离子，然后通过MALDI-TOF-IMS技术进行分析，被解吸出来的脂质离子沿着特定的轨道飞行，实现与具有相同相对质量的寡核苷酸、多肽、蛋白质和药物及其代谢物的分离，这有利于将来自脂质的离子与其他小分子物质进行区分。

5 在脑损伤研究中的应用

目前，MALDI-TOF-IMS用于脑损伤中的研究相对较少。HANKIN等[26]利用MALDI-TOF-IMS技术观察脑缺血-再灌注损伤实验模型的大鼠海马区域，特别是CA1区域中磷脂分子的分布。与对照组比较，脑缺血-再灌注损伤大鼠的海马区域可见质荷比（m/z）为548.5的离子丰度大幅度增加，通过碰撞诱导裂解技术鉴定该离子与神经酰胺有关，而神经酰胺是一种与细胞凋亡相关的脂质。该研究还利用MALDI-TOFIMS观察了外伤性脑损伤实验模型的大鼠，发现损伤区域神经酰胺的表达增多，同时磷酸胆碱钾加合物信号显著丢失，并出现相应的钠加合物离子信号的增强，这种改变是脑水肿导致的结果，原因是损伤造成Na/K-ATP酶的失活，使细胞外液流入细胞。该研究展示了MALDI-TOF-IMS在检测脂质在组织中生化改变方面的应用前景，以及为组织损伤相关生化机制的阐明提供数据支持。此外，SHANTA等[27]通过MALDI质谱成像技术检测大鼠脑缺血损伤模型脑组织中的磷脂质，比较对照组和损伤组脑组织中磷脂质的分布，利用MALDI质谱成像技术及MS/MS进行分析，鉴定脑组织中磷脂质的变化情况，与正常脑组织相比，脑缺血损伤的脑组织中有11种表达上调的磷脂质，包括溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂钠加合物和卵磷脂钠加合物。与此同时，有7种卵磷脂表达下调，包括卵磷脂钾加合物、鞘磷脂钾加合物和溶血卵磷脂钾加合物。该研究通过MALDI-TOF-IMS技术对磷脂质的鉴定，发现脑缺血损伤脑组织中的磷脂生物标志物有利于研究脑缺血损伤的机制。颅脑损伤是法医病理学实践重要的内容之一，能够利用MALDI-TOF-IMS对颅脑损伤生物标志物进行筛选和鉴定，为法医病理学的发展提供很大的帮助。

6 展 望

MALDI-TOF-IMS技术用于生物组织切片是一种新兴的分子成像技术，通过对组织切片的扫描，能够同时检测组织切片中多种未知的分子成分，结合分析软件可筛选出有统计学意义的差异分子峰，并可对这些分子峰进行定性分析，提供这些分子在组织中的空间分布信息。MALDI-TOF-IMS技术现已广泛应用于生物医学领域。而目前该技术在法医病理学中的应用还比较少，但其在法医病理学中的发展前景是非常诱人的。因其在蛋白质、多肽以及脂质等分子的定性和空间分布方面有着独特的优势，将在法医病理学研究中发挥很大的功能。

[1]CHAIT B T.Chemistry.Mass spectrometry：bottom-up or top-down?[J].Science，2006，314（5796）：65-66.

[2]SZE S K，GE Y，OH H，et al.Top-down mass spectrometry of a 29-kDa protein for characterization of any posttranslational modification to within one residue[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（4）：1774-1779.

[3]HIROSAWA M，HOSHIDA M，ISHIKAWA M，et al.MASCOT：multiple alignment system for protein sequences based on three-way dynamic programming[J].Comput Appl Biosci，1993，9（2）：161-167.

[4]GROSECLOSE M R，ANDERSSON M，HARDESTY W M，et al.Identification of proteins directly from tissue：in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry[J].J Mass Spectrom，2007，42（2）：254-262.

[5]STOECKLI M，STAAB D，STAUFENBIEL M，et al.Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry[J].Anal Biochem，2002，311（1）：33-39.

[6]黄凌瑾，陈胜喜，黄燕，等.非小细胞肺癌细胞分泌蛋白谱的鉴定[J]. 肿瘤研究与临床，2005，17（6）：364-367.

[7]SCHWARTZ S A，WEIL R J，THOMPSON R C， et al.Proteomic-based prognosis of brain tumor patients using direct-tissue matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry[J].Cancer Res，2005，65（17）：7674-7681.

[8]SCHWAMBORN K，KRIEG R C，JIRAK P，et al.Application of MALDI imaging for the diagnosis of classical Hodgkin lymphoma[J].J Cancer Res Clin Oncol，2010，136（11）：1651-1655.

[9]KO K H，KWON C I，PARK S H，et al.Application of matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight imaging mass spectrometry （MALDI-TOF IMS）for premalignant gastrointestinal lesions[J].Clin Endosc，2013，46（6）：611-619.

[10]YANAGISAWA K， SHYR Y， XU B J， et al.Proteomic patterns of tumour subsets in non-small-cell lung cancer[J].Lancet，2003，362（9382）：433-439.

[11]YE H，GEMPERLINE E，LI L.A vision for better health：mass spectrometry imaging for clinical diagnostics[J].Clin Chim Acta，2013，420：11-22.

[12]MEDING S，WALCH A.MALDI imaging mass spectrometry for direct tissue analysis[J].Methods Mol Biol，2013，931：537-546.

[13]HSIEH Y， CHEN J，KORFMACHER W A.Mapping pharmaceuticalsin tissuesusing MALDIimaging mass spectrometry[J].J Pharmacol Toxicol Methods，2007，55（2）：193-200.

[14]CORNETT D S， REYZER M L， CHAURAND P， et al.MALDI imaging mass spectrometry：molecular snapshots of biochemical systems[J].Nat Methods，2007，4（10）：828-833.

[15]RUDIN M，RAUSCH M，STOECKLI M.Molecular imaging in drug discovery and development：potential and limitations of nonnuclear methods[J].Mol Imaging Biol，2005，7（1）：5-13.

[16]HATSIS P， BROMBACHER S， CORR J， et al.Quantitative analysis of small pharmaceutical drugs using a high repetition rate lasermatrix-assisted laser/desorption ionization source[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2003，17（20）：2303-2309.

[17]KHATIB-SHAHIDI S，ANDERSSON M，HERMAN J L，et al.Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by imaging MALDI mass spectrometry[J].Anal Chem，2006，78（18）：6448-6456.

[18]LAGARDE M， GÉLOËN A， RECORD M， et al.Lipidomics is emerging[J].Biochim Biophys Acta，2003，1634（3）：61.

[19]HUANG Y，YANG J，SHEN J， et al.Sphingolipids are involved in N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidineinduced epidermal growth factor receptor clustering[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，330（2）：430-438.

[20]JACKSON S N，WANG H Y，WOODS A S.Direct profiling of lipid distribution in brain tissue using MALDI-TOFMS[J].Anal Chem，2005，77（14）：4523-4527.

[21]GARRETT T J， PRIETO-CONAWAY M C， KOVTOUN V，et al.Imaging of small molecules in tissue sectionswith anew intermediate-pressureMALDI linear ion trap mass spectrometer[J].Int J Mass Spectrom，2007，260（2-3）：166-176.

[22]CHAN K， LANTHIER P， LIU X， et al.MALDI mass spectrometry imaging of gangliosides in mouse brain using ionic liquid matrix[J].Anal Chim Acta，2009，639（1-2）：57-61.

[23]AGETA H， ASAI S， SUGIURA Y， et al.Layerspecific sulfatide localization in rathippocampus middle molecular layer is revealed by nanoparticleassisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry[J].Med Mol Morphol，2009，42（1）：16-23.

[24]JACKSON S N，UGAROV M，EGAN T，et al.MALDI-ion mobility-TOFMS imaging of lipids in rat brain tissue[J].J Mass Spectrom，2007，42（8）：1093-1098.

[25]WOODS A S， JACKSON S N.Brain tissue lipidomics：direct probing using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry[J].AAPS J，2006，8（2）：E391-E395.

[26]HANKIN J A，FARIAS S E，BARKLEY R M，et al.MALDI mass spectrometric imaging of lipids in rat brain injury models[J].J Am Soc Mass Spectrom，2011，22（6）：1014-1021.

[27]SHANTA S R，CHOI C S， LEE J H， et al.Global changes in phospholipids identified by MALDI MS in rats with focal cerebral ischemia[J].J Lipid Res，2012，53（9）：1823-1831.

2016-04-06）

（本文编辑：张建华）

Research Progress of MALDI-TOF-IMS in Biomedicine and Its Application Prospect in Forensic Sciences

REN Guan-heng1,2,WENG Rong-hua3,SHI Yan1,HUANG Ping1,LI Zheng-dong1,SHAO Yu1,DENG Kaifei1,LIU Ning-guo1,CHEN Yi-jiu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Academy of Forensic Science,Shanghai 200063,China;2.Department of Forensic Science,School of Basic Medicine Science,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;3.Chengxiang Branch of Putian Public Security Bureau,Putian 351100,China）

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight imaging mass spectrometry （MALDITOF-IMS）can analysis unknown compounds in sections and obtain molecule imaging by scanning biological tissue sections,which has become a powerful tool for the research of biomarker,lipid distribution and drug metabolism,etc.This article reviews the application of this technique in protein identification,clinical application,drug discovery,lipid research and brain injury.

forensic pathology;imaging mass spectrometry;review;matrix-assisted laser desorption;ionization

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.016

1004-5619（2017）05-0522-04

国家自然科学基金资助项目（81571851）；中央级科研院所科研专项（GY2015G-2、GY2013Z-3）；上海市科委社会发展专项（14231202500）

任冠恒（1990—），女，硕士研究生，主要从事法医病理学研究；E-mail：rgh_0101@163.com

刘宁国，男，研究员，主任法医师，主要从事法医病理学研究；E-mail：liuningguo@foxmail.com

通信作者：陈忆九，男，研究员，博士研究生导师，主要从事法医病理学研究；E-mail：chenyj@ssfid.cn