多维液相色谱及其在活性肽分离纯化研究中的应用进展

于志鹏,樊 玥,赵文竹,*,张 倩,丁 龙,刘 婧,励建荣,*,刘静波

(1.渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁锦州 121013;2.吉林大学营养与功能食品研究室,吉林长春 130062;3.吉林(市)出入境检验检疫局,吉林吉林 132013)



多维液相色谱及其在活性肽分离纯化研究中的应用进展

于志鹏1,樊 玥1,赵文竹1,*,张 倩1,丁 龙2,刘 婧3,励建荣1,*,刘静波2

(1.渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁锦州 121013;2.吉林大学营养与功能食品研究室,吉林长春 130062;3.吉林(市)出入境检验检疫局,吉林吉林 132013)

多维液相色谱分离技术以其高峰容量和高通量等优势成为活性肽分离纯化研究的重要技术,本文主要介绍了多维液相色谱分离技术的组合模式及其在混合物活性肽分离纯化中的应用,并对多维液相色谱技术在活性肽中的应用前景进行展望,旨在为从复杂体系中高效分离目标活性肽提供参考。

多维液相色谱,分离纯化,活性肽

蛋白质是食品研究领域的重要组成部分,在体内消化蛋白酶和体外工具酶的作用下,水解生成具有多种生理功能的活性肽。1986年,Jo C等以发现肽类生长因子而获得诺贝尔生理学奖,生物活性肽逐渐发展成为独立的专业,涉及多个前沿学科[1]。至此,研究也不再局限于食物来源的蛋白质,活性肽逐渐成为研究的焦点[2-3]。目前可以通过体外酶解的手段从动物和植物中制备、分离纯化具有类吗啡样活性、提高免疫和调节激素等功能的生物活性肽[4]。从这些酶解后形成的复杂线性、环形结构的不同肽类中获得所需组分,传统的单一色谱分离技术存在诸多不足[5]:反相色谱(Reversed Phase Chromatography,RPC)中短链烷基和长链烷基反相填料在样品的活性回收上有区别,烷基链越长,固定相疏水性越强,因而为使样品较快洗脱下来,需要增加流动相的有机成分,但过强的疏水性和过多的有机溶剂会导致样品的不可逆吸附和生物活性的损失[6];体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography,SEC)又称空间排阻色谱法,分为使用水溶剂的凝胶过滤色谱(GFC)和使用有机溶剂的凝胶渗透色谱(GPC),一般只用于原料液的初分离,仅获得几个分子量级组分,特别适用于对未知样品的探索分离,多肽常用水溶液的凝胶过滤色谱分析;离子色谱法(Ion Chromatography,IC)中离子交换色谱(IEC)、离子排斥色谱(ICE)和流动离子色谱(MPIC)的分离机理各不相同,所适用的待测组分也各不相同,均存在局限性,所以需综合利用多维色谱的优化组合联用方式进行分离纯化,更利于复杂样品的分离。

1 多维液相色谱简介

多维液相色谱(multidimensional liquid chromatography,MDLC)是将同种色谱不同选择性分离柱或不同类型色谱分离技术组合,构成联用系统,从而实现复杂样品充分分离的一种技术。MDLC因其将两种或两种以上具有不同分离原理的液相色谱优化组合的特性,成为活性肽的重要分离方法[7]。通过选择适当的接口,实现对多种具有不同分离机理的高效液相色谱(HPLC),包括亲水作用色谱(HILIC)、反相液相色谱(RPLC)、体积排阻色谱(SEC)、强阳离子交换色谱(SCX)、强阴离子交换色谱(SAX)等的耦联。混合肽段的分离原理是相互作用与影响的结果,样品间物理化学性质上有很大的区别,按照各个组分性质上的差异进行组分分离,其中样品组分的性质差别包括:相对分子量、分子大小、等电点、疏水性等,分离方法不止选择一种性质[8]。

Giddings在1984年首次提出了多维色谱分离的概念。根据Gidiing[9]等建立的数学模型,MDLC分离系统中的每一维都应该是正交的,具有独立的分离原理。MDLC的总峰容量(N)应为包含的各单维分离模式峰容量(Ni)的乘积,即N=N1×N2×N3×…。从理论可知,MDLC分离系统的峰容量比一维色谱更高,适用于复杂样品,其组合必须满足两点[10]:各维色谱分离应具有完全不同的分离机制;高维的分离速度应快于低维的分离速度。液相色谱-串联质谱的联用技术能有效分离高复杂程度的样品,最广泛使用的方法是离子交换色谱(IEX)和反相色谱(RP)的二维结合,用于肽段和蛋白质混合物的预分离,极大提高复杂样品的鉴定能力[11]。

Yates[12]首次提出了将强阳离子交换(strong cation exchange,SCX)色谱-反相色谱这种二维分离系统和质谱耦联,成为蛋白质鉴定技术(multi-dimensional protein identification technology,MudPIT)的高自动化分析方法。在商业化的二维液相色谱分离系统中,大多数采用自动化技术发展成熟的强阳离子交换-反相色谱串联的系统,除了SCX色谱常担任第一维分离之外,其他几种不同原理的色谱类型也能随着待研究样品的特性被选择为第一维分离。例如,肽段在发生磷酸化或糖基化修饰之后,亲水性增强,电性变化,可以使用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)[13-14]或阴离子交换色谱(anion exchange,AX)分离[15]。

在线二维液相色谱的核心是二维液相色谱将经过第一维分离的样品组分有效地转移到第二维中,根据一维洗脱产物的转移方式可分为直接转移(directly coupled -column)和间接转移(column -switching)。直接转移模式通用性差,选择性和峰容量不高,其应用仅限于SCX色谱和RPLC联用;二维液相色谱更多采用间接转移模式,通过一个特殊接口将第一维色谱柱和第二维色谱柱连接,接口收集第一维的洗脱产物,并将其转移到第二维。同直接转移模式二维液相色谱相比,间接转移模式二维液相色谱的通用性强,使用灵活,是二维液相色谱的主流技术[16]。基于二维液相色谱的理念,为了得到更高分离度样品,近年来衍生出了分离能力更强的三维液相色谱分离系统,并已在肽组学研究中得到了应用[17]。

2 多维液相色谱组合模式

多维液相色谱在实际研究中虽然高效,但并没有明确数据表明哪些色谱技术联用更适合某种活性肽分离,研究者都是根据自己所要分离的活性肽的实际情况来判断适合的多维色谱技术,以便高效快速的分离纯化目标活性肽。国内外的学者使用的多维液相色谱联用组合形式各异,主要对几种典型多维色谱方法进行介绍。

2.1 2D-HILIC-RPLC分离系统

亲水色谱(Hydrophilic interactions chromatography,HILIC)是常用于生物大分子的色谱分离技术,基于目标分子与配基间有特异性,将其中一种结合在介质上作为配基制成亲和柱,含有可结合配基的物质通过亲和柱时被吸附保留在柱上,再用洗脱液洗脱下来,达到分离纯化目的,其流动相使用的梯度与反相色谱模式(RPLC)相反,对反相液相色谱中难以保留的化合物进行有效分离。在蛋白质翻译后修饰的研究中,磷酸化肽段和糖基化肽段较非修饰肽段具有更好的亲水性,HILIC-HPLC联用系统适用于翻译后修饰蛋白质组的分子样品的分析[18],越来越多研究者将HILIC-RPLC联用的模式用于活性肽的分离分析。Wang[19]等将TSK-GEL Amide-80和Acquity BEH C18柱联用,构建HILIC-HPLC二维液相色谱系统分离人参三萜皂苷类物质,峰容量为747,正交性达到56.6%,且在二维联用系统中检测到257个质谱峰,是一维色谱的1.85倍,峰容量和正交性都优于一维HILIC或HPLC的结果。

2.2 体积排阻色谱-反相分离系统

体积排阻色谱法是根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离,体积排阻色谱-反相分离联用系统具有良好的正交性。Pan[20]等从条浒苔蛋白中提取ACE抑制肽,通过凝胶过滤色谱-半制备反相高效液相色谱联用技术,用HPLC-Q-TOF-MS鉴定活性肽序列,得到肽段PAFG,IC50值为35.9 μmol/L。Hu等[21]将强阳离子/体积排阻混合模式与纳升级反相色谱-质谱离线联用,在人血清蛋白样品中鉴定出1286种蛋白质。Wu[22]等用碱性蛋白酶酶解甜高粱蛋白制备ACE抑制肽,通过离子交换色谱-凝胶过滤色谱-反相高效液相色谱联用技术得到氨基酸序列为TLS的肽段,IC50值为102.1 μmol/L。

2.3 二维反相-反相分离系统

反相色谱对混合物的分辨力、重现性都比较好[23],但在鸟枪法中只用一维的反相色谱也是有限的,通过二维反相-反相色谱联用技术,极大改善了一维的局限性,且流动相与质谱检测条件兼容性良好。Dowell等[24]研究人员以大肠杆菌提取蛋白质来对比多维色谱分离模式,结果表明二维反相-反相色谱分离系统效果最好,鉴定出266种蛋白质。二维液相色谱分离系统(Tow dimensional liquid chromatography,2DLC)结合了不同原理的两种HPLC类型,先后对肽段混合物进行2次分离,最常用的2DLC是离子交换色谱-反相色谱的二维串联。Forghani[25]等从刺身中分离ACE抑制肽,通过RP-HPLC和等电位点分馏联用系统,并使用LC ESI-Q-TOF MS/MS鉴定肽序列,最终得到三段序列分别为EVSQGRP,CRQNTLGHNTQTSIAQ和VSRHFASYAN,其ACE抑制活性的IC50值分别为0.05、0.08、0.21 mmol/L。

2.4 强阳离子交换-反相联用

离子交换色谱用于肽的分离主要是基于带电分析物与带电固定相之间的库仑力相互作用[26-27],通过改变洗脱液的pH来中和或者转换分析物或固定相的电性,主要为阳离子交换(CX)和阴离子交换(AX)。自阳离子交换材料被发现并应用在肽段分离后[28-29],也尝试把阳离子交换的步骤应用于二维肽段分离[30]。离子交换-反相联用成为活性肽多维分离最常用的方法。在强阳离子交换色谱中的官能团强酸能使pH作用范围增大。强阳离子分离主要是根据电荷,而反相液相色谱是根据疏水性,所以强阳离子交换-反相的二维技术具有高正交性,将强阳离子交换作为第一维度,反相液相色谱因其良好的兼容性作为第二维度[31]。

2.5 三维色谱分离

为了对更复杂样品或者达到纯化水平的样品,在现有的二维色谱之前,再增加一个分离手段能提高整体样品的纯度,通常三维分离手段可以分为基于肽段分离的三维平台与基于蛋白质分离的三维平台。Wei等[33]使用了基于肽段分离的三维平台,第一维和第三维是反相色谱,第二维使用分布盐梯度通过离子交换色谱,通过反相液相色谱-离子交换-反相液相色谱的三维分离毛细管柱,分离鉴定酵母得到3019种蛋白质。刘俊彦[33]以正常人肝样品作为研究对象,建立了SEC-SCX-RPLC-MS/MS三维色谱分离质谱鉴定平台,使用体积排阻作为预分离模式,在体积排阻分离中对样品分别进行了蛋白水平预分离和肽水平预分离,结果表明蛋白水平预分离更有效。Alan[34]等利用凝胶渗透色谱-反相色谱-超高效液相色谱-二级质谱(GP-HPLC-RP-HPLC-UPLC-MS/MS)联用技术从啤酒粕酶解物中分离纯化ACE抑制肽,从12个合成肽段中,筛选出两个潜在ACE活性最高的肽段IVY和ILDL,IC50值分别为(80.4±11.9)、(96.4±8.36) μmol/L。

2.6 多维色谱阵列系统

多维液相色谱阵列技术是通过在第二维分离中采用多根并行色谱同时进行分离的方式,阵列系统能缩短整个多维系统的分离时间,来实现复杂样品的高通量分离分析。Wagner等[35]采用离子交换-反相色谱分离,其中第二维用并行的两根反相液相色谱柱构建。刘俊彦[33]采用离子交换-反相色谱分离,其中第一维是离子交换系统,第二维用18根平行的反相色谱柱构建,以肝癌组织为研究对象,鉴定出1202种蛋白质,时间由传统分离手段54 h缩短至3 h,分离通量提高8倍。

2.7 其他

高明霞[36]等通过对比“top-down”与“bottom-up”式的多维液相色谱技术路线,通过自行设计搭建的阵列式的多维高效液相色谱平台,兼容了液相色谱和“top-down”技术保留蛋白质分子信息的优势,克服系统通量问题,拥有更多的通道,能在线富集分离,实现高通量分离和高通量检测相结合,为肽组学的分析检测提供了新的思路。Roseanne[37]利用脯氨酰基内切蛋白酶酶解牛中αs-酪蛋获得ACE抑制肽,将获的高活性生物活性肽通过UPLC-ESI-MS和MS/MS联用技术进行分析得出,黑曲霉脯氨酰基内蛋白酶酶解物在C末端更容易分裂氨基酸Pro,而黑曲霉脯氨酰基内蛋白酶在C末端更有能力分裂氨基酸Ala,Leu,Arg和His。

3 多维液相色谱在活性肽分离纯化中的应用

生物活性肽是氨基酸以不同组成和排列方式构成的,从二肽到复杂的线性、环型结构的不同肽类的总称,肽分子结构介于氨基酸和蛋白质之间,是最易于人体吸收的物质[38-39]。获得高纯度的生物活性肽是后续结构鉴定及功能评价的基础,因此活性肽的色谱纯化一直是本领域的研究难点和焦点之一。Rao[40]等利用超高效液相色谱和质谱(UPLC-MS/MS)联用对已分离的鸡蛋清溶菌酶酶解液组分进行分离纯化得到ACE抑制肽,鉴定其氨基酸序列为RGY,MKR,VAW三条肽段,其中RGY作为基底,MKR,VAM具有真正的ACE抑制活性。Puchalska[41]等采用高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱技术(HPLC-ESI-Q-ToF),分离得到三种玉米抗高血压肽LSP,LQP和LRP,离子的质荷比分别为316.1867,357.2132和385.2558。Zhao[42]等利用离子交换层析-薄层色谱-高效液相色谱联用得到抗菌活性肽BL-A60,氨基酸序列为LYKLVKVVLNM,胆碱连接在N末端,细交链孢菌酮酸修饰C末端,样品在HiTrap SP HP柱(5 mL)系统,用缓冲液A(25 mmol/L MES-NaOH,pH6.2)清洗,0～1 mol/L NaCl线性洗脱,高活性组分在二氧化硅基底TLC(薄层色谱)盘上为用异丙醇∶正丁基∶氨水∶水(60∶20∶10∶20),所得样品经C18反相制备柱纯化并经馏分收集器收集,而后经Triple TOF 5600 TOFMS检测,扫描范围250～2000 m/z。Sun[43]等利用离子交换层析-凝胶过滤层析-反相高效液相色谱联用得到一种分子量为592.26 Da的抗氧化六肽LSGYGP,该肽段的羟自由基清除活性IC50值为22.47 μg/mL,Zhang[44]等通过凝胶过滤层析-离子交换层析-反相高效液相色谱分离从罗非鱼皮明胶抗氧化肽,经nano-LC-ESI质谱鉴定得到两个抗氧化肽氨基酸序列EGL和YGDEY,这两个肽段的羟自由基清除活性IC50值分别为4.61、6.45 μg/mL。

多维液相色谱技术在活性肽的分离纯化中应用越来越广泛,其组合体系无论在鉴定样品数量上还是可信程度上都优于单一色谱技术,可作为复杂样品活性肽制备过程中的重点选择方法和手段。

4 展望

生物活性肽的生理生化特性研究逐渐深入,但蛋白酶解液中活性肽组分复杂,并且不同来源的生物活性肽所用的分离纯化方法各有异同。多维液相色谱在生物活性肽的分离纯化中综合各种分离手段的优缺点,弥补单一分离手段的不足。联用技术虽然能够改善单一色谱技术的缺点,但是也不能完全消除样品制备过程中所带来的误差,需要通过不断地探索和实践来改善现有技术的缺点,不断组合创新以期减小误差。多维液相色谱还处于发展阶段,如何高效、快速、准确的分离纯化生物活性肽,还面临着巨大的挑战。多维液相色谱在食源性活性肽的研究将主要集中在:探索在经典的二维液相色谱分离的基础上增加一维肽水平的预分离,建立肽段水平上的三维液相色谱分离系统,实现有效提高活性肽分离程度和提升鉴定数量和可信度的分离目的;建立基于反相色谱、体积排阻色谱和离子交换色谱的蛋白预分离色谱的多维液相色谱分离体系,协同基于肽段水平的三维液相色谱分离手段增加活性肽鉴定的深度;综合利用定向酶切、肽质量分析及数据库分析等手段,主要通过LC-ESI-TOF-MS以及Mascot database search等蛋白质组学工具对活性肽的多维色谱纯化组分进行表征,构建肽质量指纹图谱。

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Recent advances of bioactive peptides separation by multidimensional liquid chromatography for proteome analysis

YU Zhi-peng1,FAN Yue1,ZHAO Wen-zhu1,*,ZHANG Qian1, DING Long2,LIU Jing3,LI Jian-rong1,*,LIU Jing-bo2

(1.College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Jinzhou 121013,China; 2.Lab of Nutrition and Functional Food,Jilin University,Changchun 130062,China; 3.Ji Lin(City)Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Jilin 132013,China)

Multidimensional liquid chromatography plays an important role in bioactive peptides with peak capacity and high flux,becoming one of the most interesting fields of peptides purification. The review mainly focused on the combination model of multidimensional liquid chromatography separation technology and its application in the separation of bioactive peptides,aimed to build the efficient separation methods of bioactive peptides,and prospects for application of multidimensional liquid chromatography in bioactive peptides were addressed,in order to build the efficient separation methods of bioactive peptides.

multidimensional liquid chromatography;purification;bioactive peptides

2016-11-01

于志鹏(1984-)，男，博士，讲师，研究方向：蛋白质及活性肽的功能研究与产品开发，E-mail：yuzhipeng20086@sina.com。

*通讯作者:赵文竹(1986-)，女，博士，讲师，研究方向：果蔬加工，E-mail：zhaowenzhu777@163.com。 励建荣(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水产品加工，E-mail：lijr6491@163.com。

国家自然科学基金青年项目(31601479)；辽宁省科学事业公益研究基金项目(2016004004);渤海大学博士启动项目(0515bs079)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)11-0369-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.063