分子标记技术在林木育种中的应用

杨海平，李继生，于国强 ，赵永军 ，郭来永 ，韩 彪 *

（1.山东省林木种质资源中心，山东 济南 250102；2.阳谷县林业局；3.山东鸿林工程技术有限公司；4.山东省林业科技培训中心）

分子标记（Molecular Marker）是形态标记、生化标记、细胞学标记之后逐渐发展起来的现代遗传标记，分子标记以核酸分子突变为基础，运用现代分子生物学手段，检测生物遗传结构及其变异[1]。DNA分子标记技术可以反映出生物个体和种群间基因组差异特征[2]。分子标记以DNA多态性作为遗传标记基础，反映DNA水平上遗传变异，目前共有3代分子标记技术[3]。第1代是以Southern杂交技术为基础的分子标记，它以限制性片段长度多态性（RFLP）为遗传标记。第2代是以PCR技术为基础，包括简单序列重复（SSR）、简单序列重复区间扩增多态性(ISSR）、扩增片段长度多态性(AFLP)、表达序列标签（EST）、随机扩增多态性（RAPD）等。 第3代的分子标记是基于单个碱基差异，主要是单核苷酸多态性(SNP)的标记[4]。

随着现代生物科技的发展和研究水平的不断深入，目前己相继产生了20多种分子标记技术，DNA分子标记技术不受发育状况、环境变化的影响，且标记的数量较多，多态性较高，许多标记表现为共显性，易于鉴别纯合基因型与杂合基因型，因此被广泛应用于林木遗传多样性分析，品种鉴定，构建遗传连锁图谱，种质资源评价和分子标记辅助育种等方面，在我国林木育种方面发挥着巨大的作用。

1 遗传图谱构建

遗传图谱构建是林木分子育种研究的重要内容，以分子标记为基础构建遗传图谱，对树木基因和重要经济性状进行质量和数量性状的定位，能够实现辅助选择育种。目前桉树和杨树遗传图谱研究较多，桉树中的巨桉、巨尾桉、亮果桉、赤桉、细叶桉、蓝桉已经构建了分子图谱[5-8]，杨树中毛白杨[9]、响叶杨和银白杨[10]等多种杨树也有报道[11,12]。此外，落叶松[13]、云杉[14]、柳树[15]、杜仲[16]、梅花[17]、茶树[18]、核桃[19]、麻风树[20]、榛子[21]等有较高经济价值的林木种质资源也相继构建了自己的遗传图谱。

在过去相当长的一段时间里，林木遗传图谱的构建多采用RAPD和AFLP等分子标记的方法，结合使用等位酶、RFLP、EST、SSR等分子标记技术，随着生物技术的迅速发展，现代遗传图谱的构建己由SNP等共显性标记类型组成，它在高密度、高解析度等方面取得突破，为基于图谱的相关研究提供了依据。

2 遗传多样性分析

遗传多样性是生物多样性存在的基础条件，是生态系统多样性和物种多样性的载体[22]。研究树木的遗传变异程度对于树木品种改良和林木种质资源保存研究具有重要的意义。现代分子标记技术依靠多态性丰富的特点，被广泛应用于林木种质资源遗传多样性研究。黄福平[23]依靠分子标记对中国的59个栽培茶树种质资源进行对比分析，发现59个种质的遗传多样性为0.376。Wolfe等[24]对玄参科钓钟柳属的杂种进行ISSR分子标记，结果清楚地表明物种P.clevelandii是二倍体杂种起源。唐丽[25]依靠南天竹种质资源遗传多样性ISSR-PCR体系，对湖南省13个地区种群的遗传多样性进行了系统分析。

3 数量性状基因定位

分子标记研究中数量性状基因座（QTL）是指控制数量性状的基因在基因组中的位置。在遗传连锁图谱构建的基础上，可以通过 QTL定位建立分子标记和数量性状之间的联系，从而为分子标记辅助选择（MAS）和基因的图位克隆（Map-based cloning）提供基础，据报道农艺性状和品质性状大多表现出数量性状的遗传特征，表现为连续变异，受多基因控制，表现型大多介于两亲本表现型之间。目前林木育种中定位基因座的方法有单标记分析法、复合区间作图法、区间作图法以及混合线性模型法等方法。Scalfi[26]利用 RAPD、AFLP、SSR和F1群体构建了欧洲山毛榉的遗传连锁图谱，并在此基础上进行了叶片相关性状的QTL定位。Zhang[27]利用种间回交群体对白杨的生长及木材化学成分含量进行了QTL分析，每个QTL解释表型变异的7.0%～14.6%。Billotte[28]等以油棕为材料，共获取76个表型指标相关的QTL,可解释表型变异的23%～45%。Souza[29]在构建橡胶树遗传连锁图谱的基础上对生长性状进行了QTL定位，发现春季测定树高性状相关的QTL与秋季测定树高性状相关的QTL均不一样。Gailing[30]以欧洲栎全同胞子代为材料，对叶片形态性状进行了QTL分析。林木由于生长周期长、遗传材料较难构建，给其数量性状的研究带来不便，如何进行QTL精细定位、如何分离和有效验证QTL的功能将成为林木数量性状研究重要方向。

4 种质资源鉴定

近年来，随着全球物种多样性迅速减少，拯救和保存树种种质资源被世界各国高度重视[31]，欧美等发达国家已经建立了完整的林木种质资源保护体系，我国林木种质资源收集、保存、评价和利用研究正处于快速发展阶段。种质资源鉴定是林业科研和生产的重要技术，对种质资源精准鉴定是林木育种的重要基础。传统的形态学和生化鉴定方法已无法满足科研、生产需要，分子标记技术可以从分子角度准确、快速、可靠的对林木种质资源进行鉴定和纯度分析研究。杨树和桉树是林木分子标记鉴定技术较为成熟的树种。Fossati[32]运用AFLP和SSR标记对欧洲山杨、银白杨和银灰杨个体来鉴别杂交，结果很好的区分了两树种及其杂交种。Arens通过AFLP分子标记技术，将形态上不能区分的天然杨树杂种区予以区分[33]。胡晓丽[34]利用 AFLP标记技术对现有三倍体的毛白杨和二倍体的毛白杨无性系进行了区分研究，较好的分辨出三倍体毛白杨。高建明等[35]对青杨组和黑杨组的杨树种质资源利用AFIP技术进行了鉴定和遗传相关性研究，大体上区分了我国原生品种和外来品种。桉树遗传资源丰富，种间容易杂交，我国引种的桉树在历经多年的栽培和推广后种质资源会乱，为此，利用分子标记技术鉴定桉树种质资源显得尤为重要。刘海龙等[36]对5个桉树种质资源进行ISSR标记，并与其亲本进行了遗传相关性研究。陈晓明等[37]利用ISSR技术对桉树种质资源进行了系统的指纹图谱分析。甘四明等[38]利用对7种桉树杂交亲本使用RAPD标记技术进行多态性和杂合性分析，分析出各桉树亲缘远近的关系。此外，Charters[39]运用ISSR技术鉴定收集的可可种质资源，仅使用6条引物就将62个样品中的56个品种区分开。杨恩让等[40]利用 RAPD分子标记技术将14个杜仲主要种质资源划分为五大类。沈永宝等[41]用ISSR引物构建了银杏13个主要栽培品种的指纹图谱作为品种鉴别的依据。Yao[42]利用AFLP和叶绿体SSR分子标记对杜仲种质资源的10个半野生和栽培群体进行分析，显示杜仲群体内的遗传多样性中等，栽培群体的遗传多样性相对较低，群体间分化不明显。

5 研究展望

生物学研究进入了后基因组时代，林木遗传育种学科必将随之进入到新的发展阶段。分子标记技术作为近年来飞速发展的育种技术，在林木精准育种方面发挥着巨大的作用。林木良种选育是一个周期长、任务艰巨的工作，其分子标记辅助育种体系的最终建立和应用是解决林木育种长周期问题的关键因素。林木遗传育种学家应该将传统育种方法和现代分子标记技术相结合，加强种质资源收集、保存和评价利用研究，不断提高林木育种水平，开发优良林木品种，实现“绿水青山就是金山银山”的伟大中国梦。

本文在剖析分子标记在林木育种研究中应用现状的基础上，提出以下几方面发展建议，供广大林木育种工作者和管理部门参考。

（1）加强林木基因组测序工作。树木基因组测序是一项基础性、战略性的工作，是分子标记技术的重要基础和支撑，目前，植物基因组测序主要集中在农作物和重要经济价值的草本经济作物上，树木全基因组测序研究处于相对落后状态，导致很多研究参照农作物、动物等研究上的结果，具有很大的模仿性，考虑到树木的特殊性和重要性，树木全基因组测序应该作为国家重点工程加以实施，并建立社会共享的开放平台，供广大科研工作者使用。

（2）坚持多学科交叉研究。以林木分子标记技术为手段，将林木遗传育种与森林生态学、森林培育学、森林经理学、细胞生物学相结合，将生态水平、表型水平、细胞水平和分子水平的研究相结合，从多学科交叉融合角度综合分析数量性状复杂动态的遗传调控机制，明确树木重要经济性状的遗传机制，建立多学科组合数据模型，为良种培育奠定坚实的基础。

（3）建立国家级林木分子育种平台。林木基因组普遍较大，分子标记难度大、成本高，仅靠高校和科研机构单打独斗很难完成系统性、宏观性工作，因此需要建立国家层面的林木分子育种平台，集合国内外力量共同完成分子育种重大课题。

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