红叶腺柳继代培养研究

胡 珊，李 青

（北京林业大学园林学院，花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室，国家花卉工程技术研究中心，城乡生态环境北京实验室，教育部林木花卉育种实验室，北京，100083）

红叶腺柳（Salix chaenomeloides‘Variegata’）为杨柳科柳属腺柳（Salix chaenomeloides Kimura）的优良变种[1]，其顶端新叶于3月初至10月上旬呈红色，红叶观赏期长，是为数不多的高大彩叶乔木树种，且对土壤适应性强，耐涝旱、耐盐碱、耐瘠薄，可用作观赏树、行道树、遮阴树和湖泊固堤、湿地修复等树种[2]，近年来在市场上不断推广，种苗需求量大。红叶腺柳扦插繁殖成活率虽高，但扦插时期很受局限（仅限于3-7月较合适），使其开发及利用受到极大限制。同时，扦插繁殖需要大量插条，利用组培快繁技术为其提供插条，可实现红叶腺柳的周年生产化生产。因此提高红叶腺柳在组织培养过程中的增殖系数及试管苗质量非常关键，本试验研究了继代培养过程中影响红叶腺柳丛生芽增殖及试管苗高生长的关键因素，并分析了继代过程中出现的试管苗茎尖坏死、高生长缓慢等问题的原因，提出了相关解决方法。

1 材料与方法

1.1 材料

以红叶腺柳的1年生带芽茎段为外植体，诱导侧芽萌发，以侧芽为试验材料进行继代增殖及试管苗高生长培养。

1.2 方法

1.2.1 不同细胞分裂素种类及浓度对丛生芽增殖的影响

接种侧芽于基本培养基WPM，添加细胞分裂素6-BA、KT 及 TDZ，分别设置 5 个浓度水平：0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mg·L-1。 接种 30d 后统计平均增殖系数、平均苗高。

1.2.2 不同生长素种类及浓度对丛生芽增殖的影响

接种侧芽于基本培养基WPM+6-BA0.5 mg·L-1。添加生长素NAA、IBA，分别设置4个浓度水平：0.02、0.05、0.10、0.30mg·L-1。 接种 30d 后统计平均增殖系数、平均苗高。

1.2.3 不同培养基成分对试管苗高生长的影响

接种试管苗于基本培养基WPM+6-BA1mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。 添加物分别为水解乳蛋白（0.5、1.0、2.0g·L-1）、水解酪蛋白（0.5、1.0、2.0g·L-1）、2 倍大量母液Ca2+及2倍有机母液。接种30d后统计平均苗高、生长状况。

1.2.4 不同抗褐化剂对试管苗高生长的影响

接种试管苗于基本培养基WPM+6-BA1mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。添加抗褐化剂PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、维生素C、柠檬酸、硫代硫酸钠及活性炭，分别设置 3 个浓度水平：0.5、1.0、2.0g·L-1。 接种 30d 后统计平均苗高、生长状况。

1.2.5 降低激素浓度对试管苗高生长的影响

接种试管苗于基本培养基WPM+活性炭1 g·L-1，添加不同浓度的细胞分裂素 6-BA（0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1）及生长素 NAA（0.05、0.10 mg·L-1），采用完全随机区组设计。接种30d后统计平均苗高、生长状况。

1.2.6 培养条件

接种后置于培养室中培养，培养温度24±2℃，光周期14 h·d-1，日光灯光源，光照强度2000lx。培养基中其他成分为3%蔗糖+0.6%琼脂，pH值为5.8～6。

1.2.7 数据统计

增殖系数=增殖后苗的个数（个）/接种苗的个数（个）。

样本数为每个梯度20个处理，重复2次。使用SPSS19.0对数据进行处理分析，运用Duncan多范围检验比较分析数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同细胞分裂素种类及浓度对丛生芽增殖的影响

细胞分裂素在促进DNA合成及细胞分裂中起关键作用，从而诱导丛生芽的产生[3]，故在培养基中分别添加3种不同的细胞分裂素，以期筛选出适宜种类及浓度的细胞分裂素。

表1 不同细胞分裂素种类及浓度对丛生芽增殖的影响Table1 Effect of different kinds and concentration of cytokinins on multiplication

将初代培养诱导出的侧芽切成1.5cm左右的带芽茎段接种于丛生芽培养基中。

由表1可知，当侧芽接种于WPM空白培养基时，试管苗几乎无增殖且长势不良，说明细胞分裂素对促进丛生芽增殖效果显著。试验发现，当6-BA浓度为0～1.0mg·L-1时，平均增殖系数随6-BA浓度的增加而增长。当添加6-BA浓度为1.0mg·L-1时，平均增殖系数为4.78，与其他梯度之间产生显著差异，且叶色翠绿，长势旺盛（图版Ⅰ：1）。

当6-BA浓度超过1.5mg·L-1，试管苗会出现玻璃化、茎尖坏死等现象。玻璃化现象是指试管苗呈半透明水渍状，叶色淡易破碎，长势弱[4]（图版Ⅰ：2）。关亚丽等在研究簸箕柳的组培快繁时亦发现，随着6-BA浓度的增加，玻璃化明显加强，严重影响增殖[5]。茎尖坏死现象表现为试管苗茎细弱，顶芽及嫩叶在接种20d后卷曲发黑掉落（图版Ⅰ：3），继而导致试管苗全部死亡。这可能是由于外源激素不适宜导致顶端分生组织停止分化或细胞坏死所致[3]。

细胞分裂素种类不同，对植物的效应亦有所差异。当添加KT时，平均增殖系数为3.53，但试管苗的叶片易脱落。当添加TDZ时，试管苗茎节呈扁平状，叶片皱缩发黄，平均增殖系数为0。表1的结果显示KT与TDZ对红叶腺柳丛生芽增殖没有明显的作用，在其他文献中亦有报道[6]。故诱导红叶腺柳丛生芽增殖的细胞分裂素宜选择1.0mg·L-1的6-BA。

2.2 不同生长素种类及浓度对丛生芽增殖的影响

在丛生芽增殖阶段，细胞分裂素通常与生长素组合使用为宜。在上述试验中发现，单独添加6-BA，平均苗高均在2.5 cm以下，高生长缓慢，故在培养基中分别添加NAA、IBA，以期筛选出适宜种类及浓度的生长素。

由表2可知，6-BA与生长素组合使用时比单独使用时增殖效果好。6-BA与NAA配合使用促进试管苗增殖在部分柳属组织培养中中亦有报告[5,7,8]。当NAA浓度为0.02～0.10mg·L-1时，平均增殖系数随NAA浓度的增加而增长，当NAA浓度为0.10mg·L-1时，平均增殖系数为5.77，与其他梯度之间形成显著差异。试验发现，在添加IBA的培养基里，试管苗易产生茎尖坏死现象，而在添加NAA的培养基里茎尖坏死现象较少见，且试管苗叶色浓绿。但若未及时转接培养基，亦会出现茎尖坏死现象，适宜的继代周期为30d。NAA为人工合成的生长素，通过刺激植物细胞内的NAA转化酶而生成相关生长素来刺激植物生长，但仅对含有NAA转化酶的植物起作用[9]，说明红叶腺柳体内含NAA转化酶较丰富，所以NAA对其增殖及苗高的生长产生影响。故在增殖培养时生长素宜选择0.10 mg·L-1的NAA。

表2 不同生长素种类及浓度对丛生芽增殖的影响Table2 Effect of different kinds and concentration of auxins on multiplication

综上所述，适宜的丛生芽增殖培养基配方为：WPM+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。

2.3 不同添加物种类及浓度对试管苗高生长的影响

在丛生芽增殖培养过程中会出现试管苗高生长缓慢的问题，试管苗的平均苗高均不超过2.5cm，不利于植株的生根移栽，故在培养基中分别添加不同种类的添加物，以期筛选出适宜种类及浓度的添加物。

由表3可知，8组添加物均未促进试管苗高生长。水解乳蛋白及水解酪蛋白易造成试管苗叶子发黑，植株死亡。水解乳蛋白是由乳蛋白经胰酶消化而成，氨基酸含量丰富[10]。水解酪蛋白是以天然牛奶蛋白为原料，是氨基酸、多肽 、蛋白质混合物[11]。WPM基本培养基有机母液含有甘氨酸、维生素等。可能是由于水解乳蛋白、水解酪蛋白及有机母液中的有机氮含量丰富，促进了乙烯的释放[12]，反而不利于红叶腺柳生长。适量Ca2+能抑制叶片衰老，维持叶片浓绿[13]，WPM基本培养基所含的Ca2+可能足以维持试管苗正常生长，故添加2倍Ca2+并未有效促进试管苗高生长。上述8组浓度的添加物均不适宜红叶腺柳试管苗高生长。

表3 不同添加物种类及浓度对试管苗高生长的影响Table3 Effect of different kinds and concentration of additives on elongation

2.4 不同抗褐化剂种类及浓度对试管苗高生长的影响

继代培养过程中在试管苗基部发现褐化现象，这可能是试管苗高生长缓慢的重要原因。褐化现象是指当试管苗伤口中的酚类物质在多酚氧化酶（PPO）的作用下发生氧化反应，形成有毒的醌类物质，在酪氨酸酶的作用下与试管苗组织中的蛋白质发生聚合，导致组织代谢紊乱，切面的褐色物质扩散到培养基中，最终使试管苗死亡[14]。木本植物中的酚类物质含量丰富，褐化问题一直是其组织培养中的难题。

表4 不同抗褐化剂种类及浓度对试管苗高生长的影响Table4 Effect of different kinds and concentration of browning inhibitors on elongation

由表4可知，5种抗褐化剂对抑制红叶腺柳褐化的效果不同。在活性炭浓度为0.5～1.0g·L-1时，平均苗高随活性炭浓度的升高而增长，当添加1.0g·L-1的活性炭时，平均苗高为6.49 cm，与其他梯度之间形成显著差异，且试管苗叶片肥厚，茎秆粗壮（图版Ⅰ：4）。活性炭是强吸附剂，醌类酚类皆可吸附，有效吸附根部周围伤口产生的褐色有害物质从而抑制褐化现象[15]。同时，活性炭减弱光照，保护了根端产生的IAA，可有效促进壮苗。当添加PVP时，平均苗高虽有显著提高，苗长势亦健壮，但对苗的影响不如添加活性炭显著，可能是因为PVP是酚类物质的专一吸附剂[16]，而培养基中有害物质种类较多，活性炭可起到一定的吸附作用，而PVP只能部分吸附。抗坏血酸、硫代硫酸钠对红叶腺柳试管苗高生长无显著影响，且在抗坏血酸的作用下，试管苗茎细弱发黄，不适宜继续试验。柠檬酸、硫代硫酸钠会导致试管苗发黑死亡。故抗褐化剂宜选择1.0g·L-1的活性炭。

图版Ⅰ 红叶腺柳继代培养过程 1.丛生芽；2.丛生芽玻璃化；3.丛生芽茎尖坏死；4.添加活性炭后试管苗高生长；5.激素交替培养后试管苗高生长PlateⅠ SubcultureprocessofSalix Chaenomeloides‘Variegata’ 1.Multiple shoots；2.Vitrification of multiple shoots；3.Apical necrosis of multiple shoots；4.shoot Elongation after adding activated carbon；5.shoot Elongation after using 1.0mg·L-16-BA and 0.5mg·L-16-BA alternately

2.5 降低激素组合浓度对试管苗高生长的影响

在继代培养过程中，试管苗一直处于高浓度的激素环境里可能会抑制其营养生长，促使苗增殖但不高生长，且试管苗在同一培养基里继代多次，易造成试管苗发黄退化，叶片易发黑掉落。故降低激素浓度，以期筛选出适宜的促进试管苗高生长的激素配比。

细胞分裂素质量浓度过高不仅能促进酚类物质形成，还能刺激多酚氧化酶（PPO）的活性从而造成褐化[7]。由表5可知，当6-BA浓度为0.1～1.0mg·L-1时，平均苗高随6-BA浓度的升高而增长，适当降低6-BA浓度能促进试管苗高生长及苗的质量（图版Ⅰ：5）。王关林等试验研究亦发现，当三倍体速生杨诱导出丛生芽后，若直接转入生根培养，试管苗会发黑死亡，而若将其转入低浓度6-BA培养基里，试管苗将从矮化丛生芽状态转入高生长且长壮的状态[17]。当6-BA浓度为0.5mg·L-1时，平均苗高为6.56cm，苗生长健壮，叶色浓绿。但6-BA浓度为1.0mg·L-1时，平均苗高虽与0.5 mg·L-16-BA时的平均苗高无明显差异，但在培养20d后试管苗发黄，叶片从尖端开始发黑掉落。故在试管苗高生长阶段6-BA应选择0.5mg·L-1为宜。

表5 降低激素组合浓度对试管苗高生长的影响Table5 Effect of different reduced plant growth regulators combination on elongation

3 结论与讨论

由试验得出结:适宜的继代培养周期为30d。适宜红叶腺柳丛生芽增殖培养基为：WPM+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，适宜红叶腺柳试管苗高 生 长 培 养 基 为 ：WPM+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+活性炭 1.0g·L-1。在继代丛生芽增殖培养过程中会出现试管苗高生长缓慢，茎尖坏死等现象，原因主要是褐化问题及6-BA浓度过高、试管苗长期处于同一激素种类与浓度所致。

对于褐化问题，抗褐化剂选择1.0g·L-1的活性炭为宜。活性炭是强吸附剂，可有效吸附根部周围伤口产生的各类醌类酚类物质从而抑制褐化现象[15]。PVP效果不如活性炭可能是因为PVP是酚类物质的专一吸附剂[16]，只能部分吸附培养基中的有害物质。抗坏血酸、亚硫酸钠、柠檬酸为抗氧化剂，不适宜做红叶腺柳试管苗的抗褐化剂。对抗坏血酸抑制褐化的机理，陈凯认为抗坏血酸能使多酚氧化酶失活同时消耗掉溶解氧从而阻止酚类物质氧化，但无法破坏已形成的醌类物质，所以其抗褐化效果较弱[18]。硫代硫酸钠作为有效的抗氧化剂但同时也是钙的螯合剂[19]，会降低培养基里Ca2+浓度，从而不利于试管苗生长。柠檬酸可能由于抗氧化性太强，消耗培养基中的溶解氧过量，从而促使试管苗发黑死亡。

Siddique等研究表明6-BA会抑制顶端优势，从而促进芽增殖及分化[20]，故6-BA浓度过高是抑制试管苗高生长的关键因素之一。Khan等在研究四子柳的组织培养时发现高浓度的细胞分裂素在试管苗扩繁阶段效果显著，但在生长后期应转入低浓度的细胞分裂素中，有利于试管苗的长期增殖和高生长[12]。故在试管苗高生长阶段应降低6-BA用量，6-BA浓度0.5mg·L-1与1.0 mg·L-1交替使用，可使红叶腺柳试管苗保持高繁殖率的同时，试管苗高生长显著，长势健壮，叶色浓绿。余如刚[8]、郭小燕[21]等分别在旱柳Q106、柳树优良杂交品种的继代培养时使用激素交替的方法。

试验研究了适宜红叶腺柳试管苗增殖与高生长的培养基配比，分析继代培养过程中出现的问题及其解决方法，对于如何提高成苗速度及试管苗质量，如何更适宜工厂化生产扩繁，降低成本等问题还有待进一步研究。

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