双孢蘑菇培养料微生物的研究概况*

郭仲杰

（福建省农业科学院食用菌研究所 特色食用菌繁育与栽培国家地方联合工程研究中心，福建 福州350014）

双孢蘑菇培养料微生物的研究概况*

郭仲杰

（福建省农业科学院食用菌研究所 特色食用菌繁育与栽培国家地方联合工程研究中心，福建 福州350014）

文章对国内外学者对双孢蘑菇培养料发酵过程中微生物及其活动状况的研究成果进行了综述，总结了各种研究技术的优缺点。

双孢蘑菇；培养料；微生物

双孢蘑菇[Agaricus bisporus (J.E.Lange) Imbach]，又称双孢菇、蘑菇，是世界上人工栽培、消费最广泛的食用菌，具有重要的经济价值[1-3]。双孢蘑菇是一种草腐生食用菌，没有叶绿体，生长慢，菌丝不能直接利用纤维素，农作物秸杆必须经过堆制发酵才能被利用。培养料堆制发酵是在一定的环境条件下，由原料自身或空气中所带有的微生物的生长代谢而引发的一种高温、好氧的固体发酵过程[4-5]。在该过程中，通过培养料中微生物的生长代谢活动，培养料发生了降解、转化，改变了培养料的理化性质和生物学特性，从而制造出一个高度适合双孢蘑菇菌丝生长的选择性基质[6-7]。双孢蘑菇培养料发酵过程中，微生物的生长繁殖活动是培养料发酵质量检测的一个重要指标[8]。多年来，国内外学者对于培养料中微生物进行了比较详细的研究。

1 微生物情况

1962年，Bels-koning在实验室及商业蘑菇栽培过程中首先观测到了嗜热霉菌与培养料的关系，发现凡长有较多的黑腐质霉菌H. nigrescens的培养料有较高的产量，提出用黑腐质霉菌作为判定培养料发酵成熟度的指示性霉菌。紧接着Pope等用从培养料中分离的菌株嗜热真菌作堆制能力试验，结果发现：青霉（Penicillium），Anixia和毛霉（Mucor）具有很好的堆制发酵能力，色串孢属、腐质霉属、Monotospora和毛壳霉属也具有一定的堆制发酵能力，从而提出：可以选用一些嗜热真菌应用到培养料的堆制发酵中，以缩短堆制的时间，提高发酵的质量[9]。Wiegant以嗜热色串孢为模型，研究了嗜热真菌对蘑菇生长的促进机制，发现嗜热色串孢代谢为蘑菇生长提供了一个合适的CO2浓度，可刺激菌丝尽早萌发吃料，提高在培养料中的分布面积并抑制病原菌滋生。Gribbe指出，马厩肥在发酵期间，通过嗜热微生物把很高比例的总氮固定在腐殖质和木质素的碎片上，在堆制结束时，这2种碎片占总有机质的60%～70%，是蘑菇生长的重要营养来源[10]。

1980年，Eicker从堆肥中分离出44种中温菌、藻状菌、柱孢犁头霉、大毛霉、美丽枝霉、牟勒氏接霉（Zygorynchus moelleri）构巢曲霉（Aspergilus nidulans）和酵母等。短梗帚霉（Scopulaviopsis brevia）、顶孢霉属（Acremonium spp.）匍匐曲霉（Aspergillus repens）、皱曲霉（A. rugulosus）、枝孢霉属（Cladosporium spp.）、弯孢霉（Curoulaia lunata）等发现的频率很高。1989年曾云中等、2000年、2003年姜成等分别从双孢蘑菇培养料中分离到放线菌和丝状真菌，研究表明它们对增进培养料发酵作用。2010年刘灿等发现双孢菇培养料中的微生物数量大小顺序依次为：细菌＞放线菌＞霉菌，并且都呈先减少后增加的趋势。

培养料发酵过程中发挥作用的微生物主要是细菌、放线菌，丝状真菌等。培养料中微生物的来源是来自原料农作物秸杆、禽畜粪中依附的大量的微生物种群，如在稻草茎叶表面，每克干稻草有高温细菌105个。培养料发酵开始后，一些中温型的微生物开始生长繁殖，在新陈代谢过程中产生热量使料温逐渐升高，其后一些嗜热型的微生物又开始繁殖。在培养料温度为40～60℃，这时起作用的是嗜中温型产芽孢和不产芽孢的细菌。随着料温的升高，演变成嗜热的放线菌、单孢菌和假单孢菌在起作用。二次发酵期间，主要是嗜热链霉菌属(Streptomyces)和耐腐殖霉菌属等占主导地位。

在整个培养料发酵过程中，不同类群微生物相互之间发生着密切的联系。它们之间相互影响，相互作用。这些在Stanek培养料微生物试验研究中得到了充分的验证。Stanek在以纤维素或葡萄糖为唯一碳源的分离培养基上进行的试验中发现：能分解纤维素的放线菌总伴随着耐热细菌。这些耐热细菌不能分解纤维素或者分解的能力很弱，但它们的存在能加强放线菌的分解能力，2者相互促进生长，2者混合物又能刺激蘑菇菌丝的生长。单独使用放线菌进行培养料的堆制发酵试验易污染，而用2者混合物进行培养料的堆制发酵则蘑菇的菌丝生长发育良好，不易受其他竞争性真菌的污染。

不同微生物参与不同原料的分解，使大分子化合物降解转化为简单的小分子化合物，消耗掉易被竞争性所杂菌利用的简单糖类，同时释放出料内有利于蘑菇生长发育的无机盐，留下死亡的菌体。微生物在其生长繁殖过程中产生很多次级代谢产物，是双孢蘑菇生长所需要的生长因子，如已经发现腐质霉菌产生VB1，嗜热放线菌产生泛酸、生物素、烟酸和硫胺素等。1981年Carapiet发现，嗜热真菌和细菌能把氨态氮转化为有机蛋白，其死亡菌体可以作为一种天然的缓释营养物质，是双孢蘑菇生长的重要生物养料来源。

2 研究方法

微生物形态简单、个体微小、种类繁多，缺乏明显外部特征的微生物由于缺少明显的表型特征，且其表型会因培养条件或其他处理方法而变化，各种研究获取的信息十分有限。微生物的研究方法通常分为两大类:传统研究方法及现代生物化学和分子生物学研究方法。近几十年，国内外学者通过传统研究方法，虽然从双孢蘑菇培养料分离鉴定了不少菌株，但是仍然无法全面了解发酵过程中微生物活动机理。近年来，由于现代科研装备和技术的发展，特别是分子生物学研究领域的飞速进步，更多、更先进的微生物生态学研究方法被发明创造出来，极大地推进了微生物系统的研究。

微生物的传统研究方法，直到现在仍然是微生物学研究中常用的、不可或缺的方法。传统方法主要采用一定配比的培养基和固定的培养温度，通过分离纯化和培养选育，对微生物的种群与群落多样性进行研究。微生物传统培养方法的缺点是操作繁琐，受到微生物分类的限定且有较大误差，不能检测到那些尚未能培养的微生物。分离、培养的方法采用一定配比的培养基和固定的培养温度，忽略了环境变化和生物相互作用的影响，具有明显的人工选择性。由于分离、培养法具有选择性，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少，很有可能遗漏一些有意义的微生物，制约了人们对微生物学机理的深入了解。

现代生物化学和分子生物学的方法，可以揭示微生物种类和遗传的多样性，并给出关于群落结构的直观信息。现代生物化学方法，如细胞壁、脂类、醌类和ATP分析等；分子生物学技术是通过检测样品中微生物特定的DNA或RNA片段来判断某种微生物的存在与否。自从Muyzer等首次报道了16SrDNA应用，该技术现已成为微生物多样性研究的重要工具[11]。

生物醌技术，微生物醌是能量代谢过程的电子传递体，不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌。因此，样品中微生物醌的组成，即醌指纹可在一定程度上反映微生物的群体结构。在一定条件下，微生物醌的含量相对稳定，故可利用微生物醌测定环境中的活性微生物的浓度。同时，根据微生物醌的摩尔组成还可计算出微生物的多样性和微生物种分布均匀性2个指标。

生物标志物方法，生物标志物通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。由于特定结构的标记物标志着特定类型的微生物，因此一些生物标记物的组成模式可作为指纹估价微生物群落结构。测定时，首先使用合适的提取剂提取环境微生物样品中的这些化合物并加以纯化，然后用合适的溶剂制成合适的样品用GC或LC检测，最后用统计方法对得到的生物标记物谱图进行定性定量分析。

磷脂脂肪酸谱图分析方法，原理基于磷脂几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分，细胞中磷脂的含量在自然条件下(正常的生理条件下)恒定，其长链脂肪酸的形式—磷脂脂肪酸可作为微生物群落的标记物。此外，磷脂不能作为细胞的贮存物质，在细胞死亡后会很快降解，可以代表微生物群落中“存活”的那部分群体。磷脂脂肪酸谱图分析方法适合跟踪研究微生物群落的动态变化。

16S/18S rRNA/DNA序列分析技术，由环境微生物样品总DNA的提取、引物与探针的设计、聚合酶链式反应（PCR）扩增、遗传指纹技术、16S rRNA基因（rDNA）克隆文库的构建、序列测定、序列分析与系统树构建、核酸杂交等一系列技术组成，包括了单链构象多态性、限制性片段长度多态性、随机扩增多态性DNA技术、扩增片段长度多态性和变性梯度凝胶电泳等方法。16S/18S rRNA/DNA序列分析技术不需要微生物进行分离培养，能够动态地研究微生物群落的多样性，真实反映微生物的生存状态。随着核酸序列数据库的不断补充和完善，可以实现对复杂环境微生物快速、微量、准确、简便的分类和检测。

基于16S/18S rRNA/DNA序列分析技术的PCRDGGE/TGGE法，变性梯度凝胶电泳，1993年，Muyzer首次将其就用于微生物群落研究，后来又发展出温度梯度凝胶电泳（TGGE），现在被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，是主要的分子生物学方法之一。该技术具有可靠性、可重复性、快速和容易操作等特点，缺陷是在PCR过程会产生偏差，分离的DNA片段小，反映的信息少；条件不适宜，就不能保证将有一定差异的DNA片段完全分开，产生错误的信息。国内有何丽鸿等运用采用变性梯度凝胶电泳研究双孢蘑菇培养料后发酵过程中的细菌群落结构，双孢蘑菇培养料中的细菌组成要远远丰富于人们用传统的分离方法所获得的类群，恒温阶段的培养料中不仅检测到了前人用经典培养方法获得的Bacillus属嗜热细菌,还发现了一些未曾报道的Bacilli门的成员。

原位杂交技术，以荧光染料标记的16S rDNA和16S rRNA寡核苷酸序列作为探针，按照2个核酸的碱基序列互补原则，将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，由于与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，能激发杂交探针的荧光信号，通过荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列进行定位、定性和相对定量分析，就能实现原位样品中的目标微生物的探测。

目前，双孢蘑菇培养料微生物的研究仍然主要依赖于分离、培养的传统方法。通过先进的现代分子生物学技术的应用，可以深入地了解双孢蘑菇培养料发酵过程中微生物群落的变化规律，推动培养料中有机物降解转化的理论研究，为堆制发酵技术的发展提供支持。今后双孢蘑菇培养料中微生物的研究主要内容是进一步掌握培养料中微生物生长的规律，传统方法与现代分子生物学先进技术并举，多种分析研究手段组合运用，结合培养料发酵动力学模型研究出双孢蘑菇培养料发酵的最优化控制参数，为双孢蘑菇产业持续稳定发展作出新的更大贡献。

[1] P.J.C.维德. 现代蘑菇栽培学[M]. 北京：轻工业出版社，1984.

[2] 桥本一哉. 蘑菇栽培学[M]. 北京：中国农业出版社，1994.

[3] 孔祥君，王泽生. 中国蘑菇生产[M]. 北京：中国农业出版社，2000.

[4] 杨国良. 蘑菇生产全书[M]. 北京：中国农业出版社，2004.

[5] 蔡衍山，吕作舟. 食用菌无公害生产技术手册[M]. 北京：中国农业出版社，2003.

[6] 曾广宇，周国英. 双孢蘑菇堆肥发酵研究现状[J]. 北方园艺，2007（12）：237-239.

[7] 杨国良. 国内外蘑菇工厂化生产的模式及效益[J]. 食用菌，2003（3）：29-30.

[8] 孔祥君，宋德瑜. 世界蘑菇培养料制备技术的发展[J]. 上海农业学报，1991,7（2）：91-96.

[9] Straatsma,G.et al. Taxonomy of Scytalidium thermophilum,an important thermophilic fungus in mushroom compost[J].Mycol.Res.,1993, 97:321.

[10] Wiegant, W.M. Growth characteristics of the thermophilum in relation to production of mushroom compost[J].Appl. Environ.Microbiol., 1992, 58: 1301.

[11] 许修宏,李洪涛,张迪. 堆肥微生物学原理及双孢蘑菇栽培[M], 北京：科学出版社，2010.

10.3969/j.issn.1007-550X.2017.02.002

S646.9

A

1007-550X（2017）02-0043-04

福建省科技厅公益类项目（2014R1020-6），“十二五”国家科技支撑计划“东南地区农牧废弃物多级循环利用技术集成与示范”(2012BAD14B15-401)。

2017-01-17

郭仲杰（1974-），男，高级工程师，主要从事食用菌遗传育种及栽培技术的研究，E-mail：550410857@qq.com