鸡传染性支气管炎实验室诊断技术

冯云霞

（济源市畜产品质量监测检验中心，河南济源 459000）

鸡传染性支气管炎实验室诊断技术

冯云霞

（济源市畜产品质量监测检验中心，河南济源 459000）

鸡传染性支气管炎病是危害养禽业的主要疾病之一，该病的临床和病理变化复杂多样，又常继发或并发其他细菌性、病毒性疾病，给该病的诊断带来了很大的困难，本文结合多年临床疾病诊断经验，分别从病毒学、血清学、人工感染和分子生物学方面的阐述了该病实验室诊断技术，从而为该病的确诊诊断提供一定的技术支撑。

鸡传染性支气管炎；实验室诊断技术；RT_PCR技术

鸡传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触传染性的呼吸道和泌尿生殖道疾病。由于根据流行病学、临床症状、病理变化只能作出初步诊断，确诊需要靠病毒学、血清学和分子生物学等一系列实验室检测方法。现将病毒学、血清学和分子生物学技术诊断技术介绍如下。

1 病毒学诊断技术

1.1 病毒分离与鉴定

根据病史从感染鸡的气管、肺、肾、泄殖腔、输卵管、盲肠、扁桃体、腺胃采样。一般早期分离的首选部位是气管、支气管和肺，但感染后10～14d就不易分离到。制成悬浮液，加双抗过夜，接种鸡胚或气管培养物或细胞培养物，其中气管培养最为敏感。经典方法是通过尿囊腔途径接种鸡胚，37℃培养48～72h，取出部分尿囊液进行血清学或分子生物学检测，其余鸡胚继续培养6～7d，观察侏儒胚变化。初次分离的病毒往往需要盲传3～5代或以上才能出现明显和有规律的鸡胚矮小化现象。若为阳性，需进一步通过病毒理化特性、病原性和抗原性检测进行鉴定。

1.2 干扰试验

鸡传染性支气管炎病毒在鸡胚中能干扰鸡新城疫病毒产生血凝素，且这种干扰作用可以被同型特异抗血清所抑制，特异性强，敏感性强，操作简便。具体做法是：取9～11日龄鸡胚10～20枚，分成两组，其中一组先按每枚胚0.1ml的剂量经尿囊腔接种疑似IBV的鸡胚液，另一组作为对照。孵化10h后，两组同时经尿囊腔接种新城疫病毒感染的鸡胚尿囊液，剂量每枚胚0.1ml，继续孵化36～48h，然后检测每只鸡胚的尿囊液的血凝价。若病料中有IBV存在，则试验组的鸡胚尿囊液有50%以上的血凝价在1：20以下，而对照组的鸡胚尿囊液则90%以上的血凝价在1：40或以上。该试验要严格按照上述时间操作，否则干扰作用会削弱或消失。

1.3 电镜观察

取培养的鸡胚尿囊液或病料匀浆处理后，冻融3次，10000转离心30min，上清液再以25000转离心2h左右，取沉淀用少量蒸馏水悬浮、负染、电镜下观察形态。此法不适用于大批样品检查。

2 血清学诊断技术

血清学诊断方法包括病毒中和试验、血凝和血凝抑制试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术等。

2.1 病毒中和试验

应用已知病毒检测待测血清中的特异性抗体，广泛应用于IB野毒株的分离和鉴定及血清分型，可以进行定性和定量检验。根据试验系统的不同，将病毒中和试验分为蚀斑减数试验、气管环中和试验和鸡胚中和试验，既可用固定血清稀释病毒，也可用固定病毒稀释血清。

2.2 血凝和血凝抑制试验（HI）

血凝抑制试验反应一般具有简便，快速的特点，适用于IB的快速诊断。IB的HI反应与病毒中和试验具有很好的平行性，可以作为疫苗免疫效果的判定指标，在临床上作为辅助性的检测手段。将含有IBV的鸡胚尿囊液离心浓缩后，经胰蛋白酶或卵磷脂酶C等的滤液处理后作为抗原，再按照微量法操作进行血凝和血凝抑制试验。

2.3 琼脂扩散试验（AGP）

在进行AGP试验之前，首先要进行IB抗原的制备。IB抗原制备方法有许多，有直接将感染鸡胚的尿囊膜或尿囊液作为IB抗原，即将感染的尿囊膜制成乳剂作为抗原，或者将乳剂滤液冻干，这样不仅保留了IBV的完整性，而且还可以提供AGP诊断法的特异性。

2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA可以检测传染性支气管炎病毒和抗体。在IB各种检测技术中，ELISA具有其他血清学技术无可比拟的灵敏性，而且快速、简便，表现出较强的特异性。使用同一株病毒抗原包被就可检出多种毒株的抗体水平，适用于大规模血清学调查。

2.5 免疫荧光技术

免疫荧光技术是检测鸡传染性支气管炎病毒的一种简便、快速、灵敏、可靠的诊断方法，尤其是在IBV组织嗜性的抗原定位中，更体现出该方法的优越性，但操作上较复杂，存在各毒株间的交叉反应性，不宜做临床快速诊断。

3 人工感染方法

将感染性的鸡胚尿囊液通过气管内接种或点眼感染方式，接种1日龄SPF、雏鸡或无母源抗体的健康雏鸡，经18～36h观察临床症状和病理变化。根据变化出的典型症状和病理变化进行确诊诊断。

4 分子生物学诊断技术

目前广泛用于IBV诊断及分型的分子生物学技术是反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析技术。该技术具有敏感、特异、快速等特点，即可检测感染鸡胚尿囊液，也可直接检测组织病料中的病毒。反转录-巢式聚合酶链式反应比RT-PCR更灵敏、特异，可以直接从感染病料中检出IBV。RT-PCR技术虽大大提高了检测的灵敏度，但PCR技术需要一定设备和对病料进行特殊处理，操作需要具有一定的分子生物学背景，限制了其在临床上的推广应用。此外，RT-PCR技术存在实验室污染的假阳性情况，因此用于临床样品检测时一定要慎重，务必设立对照。

[1] 张国庆，刘晶，李广兴.鸡传染性支气管炎实验室诊断技术[J].畜牧与兽医，2004，36（7）：19-20.