黑木耳菌种区别性鉴定的对峙培养法及其应用

2017-04-03姚方杰鲁丽鑫张友民张伟彤姚允武

食药用菌 2017年3期

关键词：木耳黑木耳菌种

姚方杰于娅方明王鹏鲁丽鑫张友民* 张伟彤姚允武

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（1. 吉林农业大学园艺学院，吉林长春 130118；2. 吉林省海外农业投资开发集团有限公司，吉林长春 130000）

着重介绍黑木耳菌种区别性（供检菌种和对照菌种的不符合性）鉴定的对峙培养法及其术语、定义和原理，试剂、材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验数据处理方法，以及效果。

黑木耳；菌种；区别性；鉴定；对峙培养法

黑木耳（）具有独特生态、保健功能和极高比较效益（为水稻和玉米的10～15倍）。21世纪以来，以创新的“全光间歇弥雾栽培模式”为产业化载体，使黑木耳实现了“北耳南扩”的产业发展战略[1]，产业规模迅速上升为我国第二大类食用菌。2014年我国年产黑木耳579万吨，占食用菌总产量的17.71%。伴随着黑木耳产业的快速发展，菌种使用量急剧增加，黑木耳菌种市场混乱，出现恶意侵权、同物异名、同名异物等现象，给引种、栽培和开发利用带来诸多困难，导致产量低下，产品质量参差不齐，危及黑木耳产业的可持续发展[2,3]。

科学的菌种鉴定是食用菌品种审定和生产应用的重要环节，涉及知识面广、技术性强，受到国际上的高度重视。然而，我国从国家层面到各地方，尚未建立科学有效的黑木耳菌种鉴定方法。虽曾发布实施通用的食用菌菌种区别性及真实性鉴定方法，但经本项目组及同行们的研究，发现其主要参数不符合黑木耳菌种特性。因此，作者所在团队根据对100余个黑木耳菌株的试验及查阅相关文献资料，采用体细胞不亲和性等方法，从细胞学水平、生化水平和DNA水平对黑木耳菌种进行区别性鉴定，以期为《全国食用菌菌种管理办法》的贯彻执行，防止菌种混杂退化，充分发挥优良菌种种性，以及保护菌种知识产权提供规范的方法与技术支持，推动我国食用菌菌种可追溯制度的建立与实施，促进黑木耳乃至所有食用菌产业的可持续发展。

菌种区别性是指供检菌种与对照菌种的不符合性，对峙培养法是检测食用菌菌种区别性的科学实用方法。该方法引用食用菌菌种区别性鉴定-拮抗反应（NY/T 1845）标准，适用于黑木耳菌种区别性鉴定。

1 术语和定义

NY/T 1845界定的，以及下列术语和定义适用于本文。为了便于使用，以下重复列出了NY/T 1845中的某些术语和定义。

（1）黑木耳（）。木耳科，子实体胶质，朵型分为菊花型或簇生型，耳片黑色、褐色、灰色，子实层光滑或有褶皱。（2）菌种区别性（distinctness of spawn）。供检菌种和对照菌种的不符合性[4]。（3）隆起型（ridgy）。对峙培养的黑木耳菌株间拮抗表现特征之一，表现为两菌株菌落交界处菌丝隆起[4]。（4）沟壑型（chimb）。对峙培养的黑木耳菌株间拮抗表现特征之一，表现为两菌株菌丝在交界处分别密集或稍微隆起，两隆起之间出现一条沟壑状分隔线。（5）色线型（color bar）。对峙培养的黑木耳菌株间拮抗表现特征之一，表现为两菌株菌落交界处形成一条色素分界线。（6）隔离型（dividing line）。对峙培养的黑木耳菌株间拮抗表现特征之一，表现为两菌株菌落交界处出现一条无菌丝的带状分隔区。

2 原理

两个不同的菌株对峙培养时发生拮抗反应，是黑木耳菌株识别异己保持群体遗传多样性的反映。它是由基因组内异核体不亲和位点控制的。当不亲和的两个菌株对峙培养时，在菌株交界处形成隆起、沟壑、色线或隔离，产生拮抗，防止遗传上明显不同的个体间菌丝融合，以保持个体遗传上的独立和稳定。

3 试剂、材料和仪器设备

培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），其中马铃薯200 g（用浸出汁），葡萄糖20 g，琼脂20 g，去离子水或相当纯度的水1000 mL，pH 值自然。生化恒温培养箱：精度±0.1 ℃。分析天平：感量0.01 g。

4 试验步骤

供检黑木耳菌株与对照菌株在相同条件下培养，将固体菌种从试管斜面接种到直径 90 mm的固体PDA平板上，25 ℃ 避光培养 15天。

（1）接种组合与重复次数。黑木耳供检菌株与对照菌株的拮抗反应接种组合为 3 组，每组重复 3 次。第一组：供检菌株与对照菌株对峙培养；第二组：供检菌株与供检菌株对峙培养；第三组：对照菌株与对照菌株对峙培养。

（2）接种操作。严格按无菌操作，用直径 5 mm 打孔器分别打取活化后适龄的黑木耳供检菌株与对照菌株菌落边缘做接种块。菌丝朝上，两接种块间隔 30 mm，置于平板中心位置。

（3）培养条件。在通风、避光、温度为 25 ℃ 条件下培养至接种块菌丝间接触，约需 20 ～25天。

（4）数据处理。在自然光下，观察对峙培养的两株菌落交界处菌丝，有隆起型、沟壑型、色线型、隔离型四者之一的拮抗反应，判定为不同菌株[5]。

5 讨论

我国是黑木耳生产和消费大国，占世界产量的98%以上[6]。世界上其他国家没对黑木耳此类的专项研究，因此也就没有相对有效的方法可以借鉴或者直接利用。国内迄今也尚无黑木耳菌种区别性鉴定的相关方法的报道。

目前，对于黑木耳菌种的区别性鉴定主要采用对峙培养法、RAMP法和ITS PCR-RFLP法。其中，贾定洪于2010年采用ITSPCR-RFLP方法对5个野生木耳属菌株进行分析，通过6个限制性内切酶消化获得了20条多态性DNA条带，使用NTSYSpc2.1生物软件对DNA条带信息进行分析，结果表明，ITSPCR-RFLP技术可为区别黑木耳和毛木耳菌株提供重要信息[7,8]。汤海峰利用RAMP法标记鉴定在吉林省黑木耳生产中广泛应用的品种，对22个黑木耳品种比较分析结果，发现其中存在同种异名现象[9,10]。但是上述两种方法操作起来相比对峙培养法要复杂，标记过程会耗费大量的时间和精力，并且对操作技术的要求很高，不适合普遍推广。而采用对峙培养法进行黑木耳区别性鉴定，操作方便、成本低，且鉴定结果易于观察，更适合推广使用。如陈影等和方明等在进行木耳的新品种选育过程中运用对峙培养法对黑木耳进行区别性鉴定，通过观察菌落交界处的拮抗反应进行前期试验，从而简化了试验步骤[11, 12]。孙露在2010年研究黑木耳种质资源多样性时也采用对峙培养法对黑木耳菌种进行区别性鉴定[13]。

[1] 姚方杰. “北耳南扩”的喜与忧[J]. 中国食用菌, 2012, 01: 61-62.

[2] 姚方杰, 张友民, 陈影. 我国黑木耳产业发展形势[J]. 北方园艺, 2010 (18): 209-211.

[3] 姚方杰, 张友民, 王晓娥, 等. 黑木耳菌种质量可追溯规范“表格式明白纸”[J]. 食药用菌, 2012, 04: 202-203.

[4] 食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应[S]. NY/T 1845—2010.

[5] 陈影. 黑木耳栽培种质资源多样性的研究及核心种质群的建立[D]. 长春: 吉林农业大学, 2010.

[6] 姚方杰, 张友民, 鲁丽鑫, 等. 黑木耳遗传育种研究进展[J]. 菌物研究, 2015(03): 125-128, 122.

[7] 贾定洪, 郑林用, 郭勇, 等. 5个野生木耳属菌株的ITS PCR-RFLP分析[J]. 西南农业学报, 2010(02): 449-453.

[8] 廖德聪, 陈强, 李登煜, 等. 四川省雅江松茸菌的分离与系统发育[J]. 生态学报, 2005, 25(4): 791-794.

[9] 汤海峰. RAMP在黑木耳品种鉴定中的应用研究[D]. 吉林: 吉林农业大学, 2008.

[10] 尚海英, 郑有良, 魏育明, 等. 应用ISSR标记研究黑麦属植物遗传多样性[J]. 西南农业学报, 2004 (03): 273-277.

[11] 陈影, 姚方杰, 张友民, 等. 黑木耳新品种选育研究[J]. 北方园艺, 2014 (08): 133-134.

[12] 方明, 姚方杰, 王晓娥, 等. 木耳新品种选育研究[J]. 菌物研究, 2012 (04): 263-265.