树脂纯化姬松茸多酚工艺及抗氧化活性分析

邢 鹏 吴 琪 陈峥刚 夏志兰



树脂纯化姬松茸多酚工艺及抗氧化活性分析

邢 鹏 吴 琪 陈峥刚 夏志兰*

（湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙 410128）

采用大孔吸附树脂对姬松茸粗提物进行分离纯化，以得到纯度比较高的姬松茸多酚，并研究其最佳工艺。先通过静态吸附-解析吸附实验，确定NKA-2树脂对其有比较好的效果，按所确定的最佳工艺条件，即料液浓度0.32 mg/mL，料液pH值2.0～3.0，原料液以4 BV/h的流速上柱吸附，上样体积为柱体积5 BV。再用6 BV树脂体积的80%乙醇以3 BV/h的流速解吸，在此条件下姬松茸多酚纯度为22.8%。同时测定纯化后树脂对普鲁士蓝法和水杨酸法的活性效果。

姬松茸；多酚；树脂；纯化；抗氧化活性

姬松茸（）又名巴西蘑菇、柏氏蘑菇、小松菇等，是原产于美洲巴西、秘鲁、美国的一种食药兼用菌[1,2]。富含多糖、蛋白质、氨基酸、维生素、甾醇化合物、多酚化合物等多种营养成分，具有很好的提高免疫力、抗癌、抗氧化、抗病毒等能力[3～5]。

多酚主要指植物多酚（plant ployhenols），是一类广泛存在于植物体内的复杂酚类次生代谢物，包括单宁及相关化合物，主要存在于植物的皮、根、茎和果实中，在部分真菌生物中也有发现[6]。植物多酚的提取与纯化工艺成熟，费用不高，广泛应用于食品、药理、营养、生化、日化、植物保护等领域。植物多酚结构的特点是有很好的抗氧化和清除自由基能力。酚羟基的结构特别是邻苯二酚或邻苯三酚中的邻位酚羟基，很容易被氧化成醌类结构，其对活性氧等自由基有很强的捕捉能力，能与氧化反应产生的脂质自由基结合，减少或阻止组织中氧化反应的进行[7]。

大孔吸附树脂是近些年来广泛应用于化学、医药和食品等领域的一种多孔立体结构，是由人工合成的有机高分子聚合物，能有效分离纯化黄酮、三萜、多酚等化合物。笔者在前人的研究基础上用对植物多酚的树脂纯化方式进行真菌的多酚分离纯化，并对分离后的产物进行抗氧化实验，以期探索适合于姬松茸多酚分离和纯化的最佳工艺[8,9]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

姬松茸购自长沙马王堆大市场，用粉碎机粉碎后，过60目筛，避光干燥保存备用。

主要试剂：福林-酚（FC）试剂（北京索莱宝科技有限公司），没食子酸标准品（含量﹥98%）、硫酸亚铁、乙醇、水杨酸、铁氰化钾、维生素C、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、三氯乙酸、三氯化铁（国药集团化学试剂有限公司，分析纯），30%过氧化氢溶液（天津市恒兴化学试剂制药有限公司，分析纯）。

主要仪器：FZ-102 微型植物粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），UV-2100型紫外分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司），SK3300LH 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），HY-4调速振荡仪（江苏金坛中大仪器厂），RE-52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），HH数显恒温水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂），真空抽滤装置，配有SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科技工贸有限公司），DHG-9146A型电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），真空冷冻干燥设备以及实验室常见的玻璃仪器。

图1 没食子酸标准曲线

1.2 姬松茸总多酚提取

称取5 g姬松茸粉末，用蒸馏水提取，料/液比1/20（g/mL），提取温度100 ℃，提取时间1 h。测定在765 nm波长下的吸光度值，并计算姬松茸总多酚提取得率，以此比较提取效果[10]。

1.3 没食子酸标准曲线的制作

配置0.5 mg/mL没食子酸标准品溶液：准确称量50 mg没食子酸标准品于100 mL容量瓶中，用水溶解后，定容。取20、40、60、80、100 μL标准品溶液，在10 mL玻璃管中，定容至2 mL，再加0.5 mL菲林C试剂和5 mL Na2CO3。然后在30 ℃水浴锅下水浴1 h，在760 nm UV紫外分光光度计下比色吸光度值，用清水做空白对照，重复2次。

所得标准曲线方程为：＝21.318＋0.015 6 （=0.998 2）。

式中：为吸光度值，为没食子酸含量（mg）。曲线（图1）表明，在恒定体积条件下，没食子酸的含量0.01～0.05 mg，与吸光度值以正相关系数增长。在此范围内，有良好的线性相关。

1.4 纯化工艺研究方法

1.4.1 吸附树脂的预处理和再生

树脂的预处理[11]：大孔吸附树脂先用95%乙醇充分浸泡24 h，湿法装柱，继续用95%乙醇在柱上流动洗脱，不时检查流出液，直至流出液与蒸馏水混合（体积比为1︰5）不呈白色混浊为止，然后用蒸馏水洗涤至无醇味，备用。

树脂再生：用5%的盐酸溶液洗涤树脂，至流出液呈无色，再用3%的NaOH溶液洗涤树脂，最后用蒸馏水洗至中性，即可用于下一周期。

1.4.2 大孔吸附树脂上样原料液制备

取姬松茸干燥原料，用20倍质量水在90 ℃下提取一次，每次1 h。将提取液旋转蒸发浓缩一定倍数，过滤，即得姬松茸原料液。

（1）树脂的筛选。将预处理好的6种大孔吸附树脂（ADS-17、AB-8、D4020、NKA-9、NKA-2、HPD-600）去表面水后，各精密量取1.0 g，放置于具塞磨口锥形瓶中，分别加入100.0 mL质量浓度为0.32 mg/mL的姬松茸多酚原料液，在摇床中振荡24 h，待吸附饱和，过滤，测定滤液中多酚浓度。吸附饱和的树脂再各用100 mL95%乙醇解吸24 h，待解吸完全后，测定解吸液中多酚浓度，按下列公式分别计算树脂的吸附量和解吸率（树脂吸附量以单位质量湿树脂吸附的多酚量表示）。

吸附量（mg/g）=原料液体积×（吸附前浓度－吸附后浓度）/树脂湿重 （1）

根据公式（1）和公式（2）计算获得各种树脂的吸附量和解吸率，通过比较，确定分离姬松茸多酚的最佳树脂类型。

（2）最佳pH的确定。按1.4.2中原料液的制备方法，得到pH为5.6、多酚浓度为0.32 mg/mL的水溶液，取5份各100 mL，用盐酸和氢氧化钠分别调节pH至2.0、3.0、5.6、7.0，9.0，然后加入到一系列1.0 g已去表面水的NAK-2树脂中，在摇床中振荡吸附24 h，测定吸附后溶液中多酚含量，并计算出树脂的吸附量，根据树脂吸附量的大小综合考虑，确定最佳pH。

（3）最佳料液浓度的确定。取浓度为0.32 mg/mL的原料液5份，每份100 mL，分别加蒸馏水至100、150、200、250、300 mL，将料液浓度稀释成0.32、0.21、0.16、0.13、0.11 mg/mL，同时调节pH至3.0，用50 mL的NKA-2树脂以流速3 BV/h进行动态实验。检测流出液中的多酚含量，计算树脂对多酚的吸附量，根据吸附量的大小综合考虑，确定最佳料液浓度。

（4）最佳上柱流速的确定。取pH=3.0、最佳多酚浓度的原料液5份，每份100 mL，分别按2、3、4、5、6 BV/h的流量通过装柱体积为50 mL的树脂柱，检测流出液中的多酚含量，计算树脂的吸附量，根据树脂吸附量的大小综合考虑，确定最佳上柱流速。

（5）最佳上柱体积的确定。按上述所确定的吸附条件，取pH=3.0、最佳浓度姬松茸原液以4 BV/h的流速通过装柱体积为50 mL的NKA- 9树脂柱，分步收集流出液。对流出液进行检测，测定每份流出液的吸光度值，计算树脂对多酚的吸附量，制做上样体积下树脂吸收多酚效果表。

（6）解吸剂的选择。分别取250 mL最佳多酚含量料液，以4 BV/h的流速通过装柱体积为50 mL的树脂柱，吸附完全后，先用100 mL的去离子水，再用300 mL不同质量分数（20%，40%，60%，70%，80%）的乙醇溶液分别洗脱，分别收集各部分洗脱液，检测洗脱液中的多酚含量，计算各种洗脱剂的洗脱率，选择最佳解吸剂。

（7）洗脱流速的确定。取4份各250 mL的最佳多酚浓度原料液（pH 3.0），以4 BV/h的流速通过50 mL的树脂柱，吸附后，先用100 mL的去离子水洗至流出液无色，再用300 mL的80%乙醇溶液分别以2、3、4、5 BV/h的流速进行洗脱，测定洗脱液中多酚含量，计算不同流速下的洗脱率，根据洗脱率的大小选择最佳洗脱流速。

（8）洗脱体积的确定。按上述所确定的吸附、洗脱条件，取姬松茸原液250 mL（多酚浓度为0.32 mg/mL，pH 3.0）通过50 mL树脂柱进行吸附。吸附后用水洗至流出液无色，再用80%乙醇洗脱，50 mL为一流分收集洗脱液。测定各洗脱液中的多酚含量，制作不同洗脱体积下的多酚洗脱效果表。

（9）样品纯度的检测。按上述确定的工艺条件进行2次重复试验，洗脱液浓缩后冷冻干燥，得到棕红色产品，取适量样品用水溶解，按1.3中方法检测样品中多酚含量，测定样品纯度。纯度测定公式如下所示：样品纯度（%）=样品中多酚含量／样品干重×100。

1.5 抗氧化实验

1.5.1 实验原理

用FeSO4和H2O2通过Fen ton反应，生成的自由基OH·能与水杨酸在526 nm处产生强吸收的有色产物2,3-二羟基苯甲酸。加入有清除自由基作用的多酚，可以阻止自由基和水杨酸反应，减少有色产物2,3-二羟基苯甲酸的量，降低在526 nm处的吸光度值。因此，可以用此方法检测多酚对自由基OH·的抗氧化效果[12]。

普鲁士蓝法。具有还原能力的样品可将赤血盐K3[Fe(CN)6]还原成黄血盐K4[Fe(CN)4]3。普鲁士蓝在700 nm处有最大的吸收波长。在此波长下，吸光度值越大，样品还原能力越强，抗氧化效果也越好[12]。

1.5.2 方法

（1）水杨酸法。配制不同浓度的总多酚溶液：将7.5 mmol/L FeSO4溶液、7.5 mmol/L水杨酸乙醇溶液和7.5 mmol/L H2O2溶液按1︰1︰1的比例混合，作为检测储备溶液备用。分别移取1 mL不同浓度姬松茸总多酚溶液原液于不同的玻璃管中，加入2 mL检测储备液；用去离子水代替上述样品液，其他步骤相同。在526 nm下测定加样品和未加样品的吸光度值，通过计算自由基OH·清除率，获得样品抗氧化活性。

公式：（%）＝[1－（1－2）/0]×100。

式中，为多酚对清除自由基清除率%；0为不含样品的多酚溶液检测液的吸光度；1为含多酚检测液的吸光度；2为多酚溶液的吸光度。

（2）普鲁士蓝法。配置1 mg/mL的维生素C溶液：取10、20、30、40、50、60、70 μL，定容1 mL，置于7个不同玻璃管中，依次加入1 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 6.6）、1 mL 1%的K3Fe(CN)6溶液，50 ℃下水浴20 min，再加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液，3 000 r/min下离心10 min。取2 mL上清液，加入3 mL去离子水、0.2 mL 0.1%的FeCl3溶液，混匀。以去离子水做参照，700 nm下测吸光度值。制作标准曲线，用样品代替维生素C溶液，测定吸光度值，计算对应的抗氧化活性。

所得标准曲线方程为：＝9.543 2－0.002 5 （=0.998 7）。

式中：为吸光度值；为没食子酸含量（mg/mL）。曲线（图2）表明，在0.01～0.07 mg/mL范围内与吸光度值成正相关系数增长。在此范围内，有良好的线性相关。

图2 普鲁士蓝法VC标准曲线

2 结果与分析

2.1 姬松茸多酚分离纯化工艺

2.1.1 分离纯化姬松茸多酚的最佳树脂

实验选用的6种不同的树脂都被广泛应用于不同植物总多酚的分离纯化。对姬松茸多酚的吸附及解吸结果见表1。经综合考虑，选择NKA-2树脂作为最佳树脂。

表1 6种大孔吸附树脂的吸附量与解吸率

2.1.2 原料液pH对吸附量的影响

原料液不同pH对树脂吸附量的影响见表2。从表2可看出，当原料液pH值在2.0～3.0时，树脂的吸附量比较大。根据大孔吸附树脂吸附原理，在吸附过程中吸附介质以分子状态被吸附，因此要达到较好的效果，必须使吸附介质保持分子状态。一般情况下，酸性化合物在适当酸性溶液中能被充分吸附，但是酸度过强可能导致化合物结构变化。因此，原料液在上柱前应调节pH值至3.0。

表2 料液不同pH值的吸附量

2.1.3 料液浓度对吸附量的影响

不同姬松茸总多酚浓度的料液对吸附量的影响见表3。不同初始浓度的上样液，树脂的泄漏曲线不同，树脂吸附量也不相同，浓缩后的原料液浓度为0.32 mg/mL，在原料多酚含量一定的条件下稀释成不同浓度梯度。由表3可以看出，在多酚含量一定的条件下，随着上样体积增加，树脂的吸附量减少。因此，用原液（料液浓度0.32 mg/mL）时吸附量较佳，效果较好。

表3 不同料液浓度的吸附量

2.1.4 上柱流速对吸附量的影响

上柱流速过快，多酚类化合物没有被树脂充分吸附，影响吸附量；上柱流速慢，多酚类物质可以充分吸收，但在工业化生产中会影响生产效率；故应选择合适的上柱流速。从表4可看出，随着上柱流速的增大，吸附率逐渐降低。因此选择较低流速有利于吸附率的增大。综合考虑工作效率和树脂的吸附性能，确定上柱流速以4 BV/h为宜。

表4 不同上柱流速的吸附量

2.1.5 不同上样体积下的树脂吸收多酚的效果

由表5可以看出，50 mL NKA-2树脂处理450 mL（9 BV）的原料液，此时树脂对多酚的吸附量已经基本稳定，继续上样，虽然还能继续吸附，但是吸附效果有限，造成样品的很大浪费。在上样至9 BV时饱和吸附量为92.51 mg；而在5～6 BV时，吸附效果在70%左右，则比较合适，可以减少损失率。工厂化生产控制在5 BV为宜。

表5 不同上样体积下树脂吸收多酚的量

2.1.6 不同乙醇浓度对洗脱效果的影响

不同浓度的乙醇对多酚的洗脱效果以80%乙醇洗脱的含量为最高。考虑到乙醇浓度越高，带出的杂质也越少，所以选用80%乙醇作为洗脱剂。水洗后直接用同倍体积的80%乙醇洗脱，洗脱率可达77.93%（表6）。

表6 不同乙醇浓度下多酚的洗脱效果

2.1.7 洗脱流速对洗脱率的影响

从表7可知，用相同体积的洗脱剂洗脱，流速越慢，洗脱率越高。但流速过慢，耗时太长，不经济也不利于工业化生产。综合考虑，洗脱流速以3 BV/h为宜。

表7 不同洗脱流速的洗脱率

2.1.8 洗脱体积的确定

洗脱体积对解吸附的效果见表8。从表8可以看出，当洗脱液体积达到6 BV左右时，以10个BV洗脱液总含量占比为1计，前面6个BV洗脱液所含多酚的量为43.19 mg，占比为78.90%；而后面的4个BV的多酚含量为11.56 mg，占比为21.10%。表明6 BV的洗脱体积就能把大部分多酚洗脱下来，从生产实际考虑，如果再增加洗脱体积后续处理成本高，不利于生产，故选择6 BV 80%乙醇的洗脱效果较佳。

表8 不同洗脱体积下的多酚洗脱效果

2.1.9 最佳工艺条件的确定及样品纯度检测

按上述所确定的最佳工艺条件，即料液浓度为0.32mg/mL，料液pH值在2.0～3.0左右，原料液以4 BV/h的流速上柱吸附，上样体积为5 BV（根据树脂柱体积计算），再用6 BV（树脂体积）80%乙醇以3 BV/h的流速进行解吸，重复试验2次，洗脱液浓缩后冷冻干燥，得到棕红色产品，取样品进行经检测，产品中多酚含量为22.08%。

2.2 姬松茸多酚抗氧化活性分析

从表9可以看出，姬松茸过树脂后的粗提取物，采用普鲁士蓝法和水杨酸法测定其抗氧化活性，其相对误差最高分别为1%和0.7%，其结果重复性和稳定性均良好。

表9 姬松茸过树脂后粗提取物的抗氧化活性

3 结论与讨论

配置浓度为27.27 mg/mL的样品，取样10 μL进行检测，通过计算得出样品中的总多酚含量为13.28 mg，占样品含量为22.83%。而对应地取样50 μL采用普鲁士蓝法和水杨酸法进行多酚的抗氧化活性测定，结果50 μL样品中含有总多酚0.66 mg，对应维生素C浓度为0.05 mg/mL，在此含量下，自由基清除率为79.3%～79.7%。但在本次实验中，因为姬松茸是真菌，其总多酚含量比较低，仅5‰左右，因而在提取过程中存在量少而不利于提高树脂纯化纯度。本实验是以提取和纯化植物多酚的方法对真菌的多酚提取纯化进行改良。在植物多酚的树脂纯化中，总多酚的含量一般都能提高到50%左右，而提取的姬松茸多酚在纯化过程中只能提高到20%。这里是一个技术点，在此基础上的改良还拥有很大的空间。

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Resin purification of polyphenols fromMurill and analysis of its antioxidant activity

Xing Peng Wu Qi Chen Zhenggang Xia Zhilan*

（College of Horticulture and Landscape Architecture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China）

In order to obtain the high purity pineal polyphenols, the macromolecule extract of Agaricus blazei was isolated and purified by macroporous adsorption resin, and the optimum process was studied. The effect of NKA-2 resin on the optimum conditions was determined by static adsorption-analytical adsorption experiment. The optimum conditions were as follows: 0.32 mg/mL, pH value was 2.0～3.0, The raw material liquid to 4 BV/h flow rate column adsorption, loading volume for the column volume 5 times. And then with 6 times the volume of resin 80% ethanol to 3 BV/h flow rate of desorption, under the conditions of Agaricus blazei polyphenols purity of 22.8%. At the same time, the effect of Prussian blue method and salicylic acid method on the purification of resin was determined.

; polyphenols; resin; purification; antioxidant activity

S646

A

2095-0934（2017）03-192-07

邢鹏（1992—），男，硕士在读，E-mail：978305674@qq.com

*为通讯作者，E-mail：695218379@qq.com