循环肿瘤细胞检测技术在非小细胞肺癌中的研究进展

谢升龙，薛 洋，丛 伟，△

(1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院胸外科，四川 成都 610000)

*通讯作者

循环肿瘤细胞检测技术在非小细胞肺癌中的研究进展

谢升龙1，薛 洋2，丛 伟1，2△

(1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院胸外科，四川 成都 610000)

肺癌是我国发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤，传统的诊断方法主要有病理组织学检查、影像学方法和肿瘤标志物检测。近几年的研究发现，外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)检测可用于实时、无创地进行组织学鉴定，可能成为肺癌早期诊断、复发检测、疗效评估的一个重要手段。以下对肺癌中循环肿瘤细胞检测技术进行综述。

循环肿瘤细胞；肺癌；早期诊断；复发监测；疗效评估

支气管肺癌(简称肺癌)是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，每年死亡人数达140万，占所有恶性肿瘤死亡人数的80%[1]。2011年中国恶性肿瘤发病率第1位是肺癌，每年新发病例约65万，恶性肿瘤死亡率第1位也是肺癌，每年死亡病例约52万[2]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌80%以上，由于肺癌早期诊断方法的限制，我国约75%的肺癌患者在诊断时已属晚期，5年生存率约为15.6%，而早期肺癌5年生存率能达到66.7%[3]。因此，肺癌的早期发现、早期诊断、早期治疗显得尤为重要。目前，临床上对于肺癌的诊断、监测、疗效评估主要依赖于病理组织学检查、影像学方法和肿瘤标志物检测，难以在早期发现肿瘤，也无法在早期发现肿瘤的转移和复发以及治疗效果的评估。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)指来源于实体瘤的肿瘤细胞，在不断增殖过程中具有侵袭性，细胞脱离肿瘤组织通过上皮间质转化(epithelial mesenchymal transitions，EMT)进入循环系统，成为具有侵袭转移能力的CTCs。血液中出现CTCs是肿瘤可能发生远处转移的信号，CTCs检测可比影像学检查、病理组织学检查、血清肿瘤标志物检测更早发现人体内的肿瘤细胞，是一种简便易行、可重复操作、微创的新型检测手段。

1 肺癌CTCs概述

CTCs是1869年由澳大利亚内科医生Thomas Ashworth首次通过显微镜在一名死于转移瘤患者体内的外周血中发现的，这种在外周循环中存在的与原发肿瘤类似的细胞称为CTCs[4]。由于受限于当时的科学技术和医学技术的发展，这种在外周血中发现的肿瘤细胞并没有被医学界充分重视。直到本世纪初，随着医学科学技术的发展，通过使用先进的医学设备才得以发现CTCs的临床使用价值。多项临床研究发现[5～7]CTCs检测技术能在肺癌的辅助诊断、复发监测、疗效评估方面发挥重要的临床价值。

在过去的几十年里，对于NSCLC的治疗，化疗基础之上的综合性治疗得到了飞速的发展。而肺癌驱动基因突变的发现，使得医学界对于NSCLC的分类得到了重新的认识，同时改变的还有非小细胞肺癌的治疗[8]。基于表皮生长因子受体(epidermalGrowth Factor Receptor，EGFR)突变和间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)基因重组，也已成功的研发出了相对应的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhabitors，TKIs)靶向治疗药物。基于其他驱动基因突变(如ROS、MET、RET、BRAF)也有了相对应的治疗策略。但是，涉及驱动基因突变的个体化治疗的患者在整个非小细胞肺癌患者中只占到了一小部分，还有绝大部分患者依靠目前的检测手段无法找到合适的个体化治疗方案或者对现存的个体化治疗方案耐药。

2 CTCs的检测方法

由于CTCs在其外周血中的数量很少，每105～107个有核细胞中才有一个CTCs[9]，因此对CTCs 的检测技术要求更为准确、敏感。CTCs的检测方法主要分为两部分：CTCs富集技术和CTCs检测技术。目前，CTCs检测方法有很多种，但是，理想的检测方法应该是：高度敏感、高度准确、易于操作。

2.1 CTCs富集技术 CTCs检测的富集技术主要基于CTCs的生物学特性和物理学特征(如CTCs的大小、密度、带电性、可变形性、细胞表面蛋白、生存能力和侵袭性)进行富集。目前常见的富集方法有：①密度梯度离心法：利用商品化的分离液，将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，根据血液中各种细胞的密度不同，离心后各种细胞成分分层，从下向上依次为：红细胞、中性粒细胞、分离液、单个核细胞 (包括CTCs)，最上层是血浆，为防止离心前血细胞与分离液混合而不利于分离，建立了OncoQuick 方法，用一种专用的50 ml试管，在分离液与血液之间放置多孔屏障，这种方法的局限性是部分肿瘤细胞可迁移至血浆层或在离心管底部形成非特异性的聚合物而丢失 CTCs[10]。②免疫磁珠法：免疫磁珠分离技术是目前比较常用的CTCs分离和富集技术。他的原理是基于CTCs主要表达上皮源性表面标志，利用抗原抗体方法分离和富集CTCs，具体分为阳性富集方法和阴性富集方法。前者通过磁珠偶联上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM)和细胞角蛋白(cytokerins，CKs)等标志直接富集外周血中上皮来源的循环细胞。后者通过磁珠偶联CD45等白细胞标志，去除外周血白细胞而间接富集稀有上皮细胞。目前基于免疫磁性原理富集或同时检测CTCs的技术主要有CellSearch系统、免疫磁性细胞分选仪(magnetric cell sorting，MACS)，AdnaTest癌细胞检测系统和莱尔系统等[11]。③膜过滤法：膜过滤法主要基于肿瘤细胞的尺寸一般较大的特点(平均直径超过8 μm)[12]。肿瘤细胞尺寸分离 (isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)技术，主要是利用肿瘤细胞直径一般大于正常细胞的物理特性来分离CTCs。将血液通过孔径为8 μm的滤膜过滤，正常细胞滤过而CTCs聚集于滤膜上，从而达到富集作用。然而，外周血中单核细胞大小跨度较大，直径可达17 μm左右。因此，此方法不仅可能会漏掉直径较小的CTCs，更可能捕获较大的白细胞，从而使得其灵敏性及特异性下降[13]。

2.2 CTCs检测技术 CTCs的检测技术则是对CTCs表达的特异性组织蛋白或者mRNA进行检测。目前的方法有：①配体靶向PCR技术(ligand-targeted PCR method，LT- PCR)：这种检测技术是我国首创的检测技术，他的基本原理是肺癌患者的CTCs表面会过量表达某些特异性受体，如叶酸受体(folate receptor，FR)，靶向PCR运用的配体类似物交联核苷酸片段作为检测探针，通过细胞表面特异性受体与其配体类似物的结合以实现探针与CTCs的结合，从而将CTCs的数目转化为探针的数目，然后通过对探针的PCR定量检测来计算CTCs的数目。由于具有受体配体结合(1个CTCs表面存在上万个特异性受体)及PCR的两次信号放大，从而可使1个CTC信号放大约1012倍。因此，配体介导的靶向PCR法，具有超高的灵敏度的特点，从而使早期肺癌中探测CTCs成为了可能[14]。②逆转录-聚合酶链反应法(reverse- transcriptase PCR，RT-PCR)：RT-PCR检测技术是通过检测上皮源性肿瘤细胞的mRNA以达到对CTCs检测的目的。这种技术能够将血循环中数量极低的mRNA通过聚合酶链反应，使检测底物数量呈指数增长，再进行检测，具有灵敏度高，价格低廉的特点，是目前检测肿瘤隐匿微转移最有效的方法。但是这种方法的缺点在于检测过程中需要破坏CTCs，并且取样过程中很容易污染，造成检测结果呈假阳性，因而限制了这项技术的发展[15]。③流式细胞技术(flow cytometry，FCM)：CTCs是依靠携带荧光物质的抗体和肿瘤细胞特异标志物结合，使得肿瘤细胞“染色”，然后再用流式细胞仪进行鉴定分析。这项技术是一种在功能水平上对CTCs进行定量分析和分选的检测手段。他可以高速分析上万个细胞，同时从一个细胞中测得多个物理、化学参数。对细胞进行分析的同时还可以对细胞进行分选。尽管FCM 检测方法相对简便，具有速度快、精度高、准确性好等优点，但FCM 检测方法因在形态学方面存在先天不足，因而在细胞形态学上确认肿瘤细胞，仍然有必要采用镜下特异性免疫组织化学染色[16]。④免疫荧光法(immunofluorescence，IF)：是将通过荧光标记的特异性抗体在CTC原位进行抗原抗体反应，再使用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。这项技术依靠表达于多数上皮源性恶性肿瘤细胞表面的抗上皮细胞黏附因子(EpCAM)抗体进行免疫磁珠吸附来捕获CTCs，并用4，62-二脒基-222-苯基吲哚(DAPI)染色(说明捕获到的细胞为有核细胞)进一步确定捕获细胞的特征，并用抗细胞角蛋白(CK)抗体(说明捕获到的细胞为上皮细胞)及抗CD45抗体(说明捕获到的细胞非白细胞)进行免疫荧光分析。这些研究证实了CTCs计数在常见实体恶性肿瘤中的临床意义。目前国际上最常用的CellSearch CTCs检测系统便是使用免疫荧光法，这项免疫磁珠捕获EpCAM阳性细胞的技术，已被证实在乳腺癌、前列腺癌及大肠癌具有明确的预后预测价值[17]。但是，这项技术在肺癌领域的敏感性较低，通过CellSearch系统检测101例原发性肺癌患者的CTCs，发现在7.5 ml外周血中，只有32%的IV期肺癌患者外周血能见到CTCs，IIIa期患者的检出率为0[18]。这主要是因为CellSearch系统主要通过上皮表型EpCAM来识别CTCs。而肺癌CTCs在迁移入血的过程中通常会发生EMT，从而丢失了上皮细胞特征。因此，以上皮表型EpCA M 来检测肺癌CTCs的方法，可能会产生假阴性的结果[14]。⑤循环肿瘤细胞芯片技术(CTC-Chip)：第一代的CTCs芯片是一种基于微流体学的CTCs检测技术。它在一张与标准载玻片尺寸相同的硅片上面覆盖 8 万个显微位点，每一个位点都包被上能够捕获CTCs的抗体。当血液样品通过微流芯片时，这些位点确保CTCs在流过芯片前捕获它们。第二代 HB 芯片将微芯片安装在标准载玻片上，利用标准的，病理检测方法对癌细胞进行鉴别，在增加血液样本处理量的，同时，提高了捕获罕见CTCs的能力。HB 芯片从几例患者的血液样本中捕捉出4～12 个CTCs群，而过去捕捉的CTCs中从未发现此类的肿瘤细胞群。这项新技术对肿瘤转移进行更精密的研究以及进一步地开展靶向性癌症治疗的临床研究提供了一个有力的平台[19]。

3 小结

外周血中CTCs的检测及评估有助于肿瘤的早期诊断，判断预后，评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案，是一种具有高度可行性和可重复性的非侵入性新型诊断工具。一般来说，保证特异性前提下的高敏感度、便于临床应用、可重复性好是CTCs检测技术的三个重要评判标准。CTCs的富集技术已经日趋成熟，通过高效的富集方法，能否通过病理学手段对循环中的肿瘤细胞进行病理学判定，有助于我们对患者进行真正的无创“液态活检”[20]。但目前CTCs检测的临床应用仍然存在诸多亟待解决的问题。在未来的研究中，单纯CTCs的计数是不够的，通过CTCs基因表达确定特定亚型可能更为重要。肿瘤患者形成转移可能性，在通过分子生物学技术对CTCs的提取、分离及分析中得到与之相关的信息。未来，“抗CTCs”的治疗目标将是一个富有成果的战略，其从根本上防止转移灶形成，并对复发或者接受根治性治疗的患者进行有针对性的个体化治疗。CTCs的相关研究中，在不同种类的肿瘤疾病中，有来自不同技术方的明确证据显示外周血中CTCs的数量及预后之间存在相关，对于早期和晚期肿瘤患者的预后均有相关。同样，肿瘤辅助治疗过程中CTCs 似乎可以作为疗效的指标。这是否可取代现有临床肿瘤检测“金标准”CT-断层影像图像仍待观察，但这是令人振奋的前景。CTCs的检测，是非侵入性的活检，在NSCLC的研究中我们可以将CTCs与已知的EGFR突变检测相互结合，对收集到的CTCs直接进行基因分析，反映原发肿瘤的情况。对于CTCs的研究，未来广泛实现使用非侵入性的基因检测并指导靶向药物治疗，也可能成为临床肺癌诊治的必要手段。

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Advances in the detection of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer

XIE Sheng-long，XUE Yang，CONG Wei

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B

1672-6170(2017)03-0135-03

2017-01-13；

2017-03-24)