急性早幼粒细胞白血病小鼠动物模型建立的研究现状

王艺潼 综述 徐 雯 审校

急性早幼粒细胞白血病小鼠动物模型建立的研究现状

王艺潼 综述 徐 雯 审校

急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)是造血组织的一类恶性疾病。动物模型是探讨人类相关疾病的重要工具。研究表明，APL小鼠模型可以通过转基因、逆转录病毒介导和白血病细胞移植的方法建立，且该三种方法建立的模型均可再移植。这些模型的建立为了解APL发病机制和疗效研究奠定了基础。判断模型是否成功建立，可以通过血常规、血涂片和骨髓涂片检查、免疫学、分子生物学及病理学的相关检查完成。成功建立APL动物模型，可为研究人类APL发生、发展和评价药物疗效提供重要的实验基础及理论依据，从而有助于人们进一步了解APL。

急性早幼粒细胞白血病；动物模型；FVB/NJ小鼠

急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)为急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia，AML)M3型，是造血组织的恶性疾病。当前对APL的研究已获得很大成果，三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)和全反式维甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)联合疗法使患者的五年生存率升至95%。APL动物模型的建立有助于更全面地认识白血病的本质，为研究白血病的增殖、分化及其调控机制提供实验依据，成为研究人类白血病的发生、发展规律和评价某些药物疗效的极为重要的手段和工具，并且可作为探索白血病治疗手段的重要方法。

1 APL概述

APL是AML的一种特殊类型，被法美英(France，American，Britain，FAB)协作组定义为AML-M3型[1]。APL以17号染色体上维A酸受体α(RARα)基因与15号染色体的早幼粒细胞白血病(PML)基因相互易位，即t(15；17)(q22；q21)而形成PML-RARα融合基因为主要特征[1-2]。PML-RARα融合蛋白可抑制早幼粒细胞的分化成熟，使血液系统中的成熟粒细胞减少，早幼粒细胞增多；使得PML抑制增殖和促进凋亡的功能发生障碍，从而导致增殖加快、凋亡减少，骨髓中异常早幼粒细胞的不断增殖并大量堆积。

目前治疗APL主要分为蒽环类药物的传统化疗、ATRA诱导分化治疗和砷剂的诱导凋亡治疗三类。20世纪70年代哈尔滨医科大学张亭栋教授等人率先使用ATO治疗APL患者，并取得满意疗效[3]。多年实践及大量实验研究表明，ATO单剂治疗APL的完全缓解(CR)率可高达85%～90%，同时可延长患者生存期，且不良反应轻[1，4-5]。ATRA单剂治疗APL，90%患者可获得血液学缓解，但通常在数月后复发，再用ATRA无效且具有白细胞增多症、维甲酸综合征和维甲酸耐药等弊端。而ATRA联合蒽环类药物为主的化疗对于初诊APL诱导治疗有效，可使70%～75%的患者得到治愈。在保证疗效情况下，使用ATO治疗方案相比于ATRA联合蒽环类药物的化疗方案，在经济上更能减轻患者负担[6]。

2 APL小鼠模型

因小鼠在遗传学与造血系统等方面与人类十分相似，且繁殖力强、生命周期短，因此选用小鼠作为研究人类白血病的实验动物相对比较理想。目前建立小鼠APL模型的方法主要有以下三种：转基因法、逆转录病毒介导和移植APL白血病细胞。

2.1 APL转基因小鼠模型

研究表明，将人类组织蛋白酶G(hCG)基因的质粒进行改造，在hCG基因的5′侧翼区和第一外显子间插入PML-RARα融合基因，使用相应连接酶将PML-RARα和hCG连接，转化，筛选可成功获得含hCG-PML-RARα阳性基因的质粒，经酶切获得hCG-PML-RARα转基因构件，将转基因构件hCG-PML-RARα通过显微注射技术注入小鼠受精卵的雄性原核内[7]，通过基因组DNA进行PCR整合检测hCG-PML-RARα转基因小鼠，将获得的阳性G0代转基因小鼠与同品系正常小鼠交配得到F1代，即可构建转基因APL小鼠模型[8]。

在转基因APL小鼠模型构建过程中，在人组织蛋白酶G或迁移抑制因子相关蛋白8(MRP8)启动子控制下表达PML-RARα，且在原始细胞向中幼粒细胞分化的过程中，活化的hCG启动子和表达于髓系祖细胞和粒、单细胞分化过程中的hMRP8启动子，可以有效地将原始细胞分化阻滞在早幼粒细胞阶段[9]。对有明显表征的小鼠可以通过外周血、骨髓象、病理学检查以及使用RT-PCR方法检测转基因小鼠骨髓细胞中融合基因的表达情况，结果证实hCG-PML-RARα转基因小鼠发生了APL[7-8]。

2.2 逆转录病毒介导的小鼠模型

APL的主要特征是染色体易位，累及的基因主要编码转录因子为RARα转录因子家族。而17号染色体上的RARα基因融合到可变配偶体(如PML、PLZF、NPM、NuMA和STAT5B：X基因)，形成具有相同RARα部分的APL特异性融合蛋白的表达[10-11]。其中95%以上APL患者携带t(15；17)形成的PML-RARα融合基因，另有约2%患者携带t(11；17)形成的PLZF-RARα和RARα-PLZF基因。因APL的发生大多与PML-RARα融合基因有关，相应的逆转录病毒介导的小鼠模型都是基于PML-RARα融合基因，而PLZF-RARα基因的逆转录小鼠模型报道甚少[11-12]。

逆转录病毒载体构建是建立逆转录病毒小鼠模型的第一步，是影响目的基因表达的关键因素[12]。研究表明，用逆转录病毒介导的以骨髓细胞为主的造血干细胞移植可建立三种模型：PML-RARα、PLZF-RARα和PLZF-RARα/RARα-PLZF[11，13-14]。即将PML-RARα、PLZF-RARα和PLZF-RARα/RARα-PLZF融合基因分别通过相应酶切位点克隆到逆转录病毒载体，构建三种质粒，而后经过逆转录病毒的制备，将供体小鼠骨髓与逆转录病毒上清液共培养，最后分别移植相应的逆转录病毒感染的小鼠骨髓细胞。经鉴定这三种模型均可发生APL、可再移植且生存周期短，其中PLZF-RARα/RARα-PLZF最为典型，但对ATRA不敏感[15]。

2.3 移植APL细胞法

目前建立的多种肿瘤模型主要使用免疫缺陷动物，由于其免疫系统缺陷，异体移植的肿瘤成功率高，便于临床研究。大量研究表明，目前建立APL小鼠模型大多使用重症联合免疫缺陷小鼠(Severe combined immunodeficiency，SCID)或非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠[9，15-16]。SCID小鼠是由17号染色体隐性突变而来，1980年Bosma从C.B-17/lcr小鼠群中发现该突变。SCID小鼠表现出严重的免疫缺陷症状，T、B淋巴细胞严重缺乏，导致细胞免疫和体液免疫功能缺陷，并对外源性抗原不能产生抗体，也不能产生细胞免疫反应。而NOD/SCID小鼠相比于SCID小鼠，NK细胞缺陷，循环补体缺乏，是一种免疫缺陷更严重的实验动物[16]。故选用免疫缺陷小鼠建立肿瘤模型成功率相对较高。在移植细胞的选择上许多实验室选用人源的NB4细胞(5×106～1×107/只)，经尾静脉注射至SCID小鼠体内，从而建立APL小鼠模型[16-18]。因SCID小鼠仍存在一定的免疫功能，即存在NK细胞、巨噬细胞和粒细胞，SCID小鼠建立模型之前，需要经射线处理，使小鼠免疫系统损伤程度达到一致。若将小鼠分为照射组和非照射组，对比发现照射组小鼠更能模拟临床白血病弥漫生长和累及器官的特点[9]。

目前为了研究药物对APL作用的免疫学机制，则需要在免疫功能正常的小鼠中建立APL小鼠模型。现有文献报道，如果加大移植肿瘤细胞的注射剂量，可以用免疫功能正常小鼠成功建立模型[19-20]。研究显示，用免疫功能正常小鼠建立模型所需要的白血病细胞剂量比SCID小鼠建模时所需的剂量要高100倍[14]。Pollock等在2005年的研究显示，免疫功能正常小鼠(B6C3H)注射APL细胞(来源于表达PML-RARα基因的转基因小鼠)的绝对致死剂量为104～106个细胞。细胞注射量为104时SCID小鼠的长期无白血病存活率为0，免疫功能正常小鼠为60%；细胞注射量为106时两组小鼠无白血病存活率均为0[19]。有文献报道，免疫功能正常的FVB/NJ小鼠注射同源的hMRP8-hPML-RARα APL转基因小鼠脾脏来源的APL细胞(1×104)，小鼠全部发病(潜伏期约为两周)[20]。

3 模型鉴定

3.1 一般观测指标

据文献报道[8-9，21]，小鼠若患APL，则出现体重下降、活动度下降、竖毛、皮肤溃疡等变化，并常伴有精神萎靡、活动减弱、步态不稳、行动缓慢等类似人白血病的症状，也可在腹腔内观察到实体瘤。

3.2 外周血检查

Rego等[22]在2000年提出模型建成的辅助判断标准，即外周血早幼粒细胞>1%；白细胞增多(白细胞>3×104/mm3)；贫血(血红蛋白<10 g/dL)和/或血小板减少(血小板<5×105/μL)。

3.3 血涂片和骨髓涂片检查

细胞形态学检查作为模型判定标准之一，可更为直观反应模型建立情况。其中APL小鼠血涂片标准为外周血中早幼粒细胞>1%[22]。血涂片中早幼粒细胞早期可占白细胞总量的1%～4%，后期占白细胞总量的3%～11%[23]。其中白细胞分类以异常早幼粒细胞为主，APL小鼠外周血白细胞总数明显升高，粒系/淋巴系比例会明显升高。APL小鼠骨髓涂片判断标准为骨髓中早幼粒细胞≥30%。骨髓细胞分类以颗粒增多的早幼粒细胞为主，可高达60%～75%，红系和淋巴系增殖受到抑制，红系和巨核系均明显减少[7-8]。

3.4 免疫学检查

有文献报道显示[16，24-25]，使用流式细胞仪检测发病小鼠骨髓细胞CD33的阳性表达率高达90%，且特异性较高。尤其在白血病细胞浸润的肝、脾、肺等脏器中，CD33均强表达。

3.5 分子生物学检查

约95%的APL具有特异性的染色体易位t(15；17)(q22；q21)，此易位导致7号染色体上维A酸受体α(RARα)基因与15号染色体的早幼粒细胞白血病(PML)基因相互融合而形成PML-RARα融合基因。研究表明，取患病小鼠脾脏细胞，通过Western blot、RT-PCR等检测方法，可在发病小鼠体内检测到PML-RARα融合基因的表达[12，16]。

3.6 病理学检查

通过对濒死APL小鼠相应脏器进行病理检查，可见早幼粒细胞在肝、脾、骨髓等器官及组织内浸润增殖。其中脾脏的正常结构被破坏，脾小结破坏，红髓内有大量早期粒细胞浸润；肝脏内组织结构破坏，有散在灶状分布的粒细胞浸润，血管腔、血窦内可见大量粒细胞；肺脏组织切片显示肺泡塌陷，肺泡壁、肺血管内可见许多粒细胞浸润；骨髓腔变小，细胞的正常分布消失，可见有大量的早幼粒细胞[13，16，26]。

4 小结与展望

通过转基因、逆转录病毒和细胞移植的方法可以建立APL小鼠模型，并通过相应判定指标来判断模型是否成功建立。建立具有APL表型的转基因小鼠模型，可以从动物整体水平上证实PML-RARα融合蛋白对APL发生的作用[6]。在逆转录病毒介导的APL小鼠模型中，小鼠均发生类似人白血病症状。相比于转基因小鼠APL模型，逆转录病毒介导的小鼠APL模型周期短、耗时少，有利于白血病的克隆和移植的分析，并且可以检测癌基因在不同的造血干细胞中的表达和影响[27]。细胞移植法建立的动物模型，具有经济简便、稳定性好、特异性强、成功率高的特点。由于免疫系统严重缺陷，SCID小鼠比免疫功能正常的小鼠更容易诱导致命的APL。但是，因SCID小鼠仍存在一定的免疫功能，建立肿瘤模型前需经照射处理。SCID小鼠建立APL模型的研究较多，相对成熟。而使用免疫功能正常小鼠建立APL模型的研究较少，但因免疫系统健全，更适用于免疫学机制的相关研究。因此，建立APL动物模型能很好的模拟临床APL发病特点，为研究药物筛选和临床治疗提供良好的动物模型。

1 Cicconi L，Lo-Coco F.Current management of newly diagnosed acute promyelocytic leukemia[J].Ann Oncol，2016，27(8)：1474-1481.

2 Testa U，Lo-Coco F.Prognostic factors in acute promyelocytic leukemia：strategies to define high-risk patients[J].Ann Hematol，2016，95(5)：673-680.

3 饶毅，黎润红，张大庆.化毒为药：三氧化二砷对急性早幼粒白血病治疗作用的发现[J].中国科学生命科学，2013，43(8)：700-707.

4 Iland HJ，Bradstock K，Supple SG，et al.All-trans-retinoic acid，idarubicin，and IV arsenic trioxide as initial therapy in acute promyelocytic leukemia(APML4)[J].Blood，2012，120(8)：1570-1580.

5 Lou Y，Qian W，Meng H，et al.High efficacy of arsenic trioxide plus all-trans retinoic acid based induction and maintenance therapy in newly diagnosed acute promyelocytic leukemia[J].Leuk Res，2013，37(1)：37-42.

6 高晓慧，田新，杨春会，等.急性早幼粒白血病的治疗进展[J].实用临床医学，2015，16(6)：98-100.

7 孟秀琴，成国祥，曹文俊，等.PML-RARα转基因小鼠发生急性早幼粒细胞白血病[J].中国实验血液学杂志，2000，8(2)：104-109.

8 董颖，陈娟丽，陈思宇，等.hCG/RARα/PIZF转基因小鼠发生髓系增殖性疾病[J].中华血液学杂志，2004，25(12)：745-747.

9 王骏，王珊珊，杨德宣，等.人急性早幼粒细胞白血病小鼠模型的建立[J].中国临床药理学与治疗学，2013，18(8)：858-864.

10 Rego EM，Ruggero D，Tribioli C，et al.Leukemia with distinct phenotypes in transgenic mice expressing PML/RAR，PLZF/RAR or NPM/RAR[J].Oncogene，2006，25(13)：1974-1979.

11 施琳，王月英，陈赛娟.逆转录病毒介导的髓系白血病小鼠模型研究的最新进展[J].中国实验血液学杂志，2011，19(4)：1058-1063.

12 Wartman LD，Welch JS，Uy GL，et al.Expression and function of PML-RARA in the hematopoietic progenitor cells of Ctsg-PML-RARA mice[J].PLoS One，2012，7(10)：e46529.

13 陈娟丽，董颖，陈思宇，等.PLZF-RARα/RARα-PLZF双阳性转基因小鼠发生白血病模型研究[J].中国实验血液学杂志，2005，13(6)：924-931.

14 Kogan SC.Moue models of acute promyelocytic leukemia[J].Curr Top Microbiol Immunol，2007，313：3-29.

15 Nasr R，Lallemand-Breitenbach V，Zhu J，et al.Therapy-induced PML/RARA proteolysis and acute promyelocytic leukemia cure[J].Clin Cancer Res，2009，15(20)：6321-6326.

16 杨文华，于文俊，史哲新，等.人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型的建立[J].现代肿瘤医学，2009，17(4)：605-608.

17 Liu YF，Zhang M，Cheng XY，et al.Establishment of the human acute promyelocytic leukemia pathological model in the SCID mice by using NB4 cell line[J].J Exp Hematol，2015，23(1)：50-54.

18 Li H，Wang R，Li XX，et al.Carnosic acid-combined arsenic trioxide anti-leukaemia cells in the establishment of NB4/SCID mouse model[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2016，119(3)：259-266.

19 Pollock JL，Lane AA，Schrimpf K，et al.Murine acute promyelocytic leukemia cells can be recognized and cleared in vivo by adaptive immune mechanisms[J].Haematologica，2005，90(8)：1042-1049.

20 黄檬檬，诸江，胡烔.急性早幼粒细胞白血病小鼠模型中造血增殖、定位和迁移特点的研究[J].诊断学理论与实践杂志，2013，12(3)：326-329.

21 付林林，陈日玲，赵桂娟，等.SCID小鼠-人白血病模型中关键因素的分析[J].中国实验血液学杂志，2015，23(1)：55-60.

22 Rego EM，He LZ，Warrell RPJ，et al.Retinoic acid(RA)and As2O3treatment in transgenic models of acute promyelocytic leukemia(APL)unravel the distinct nature of the leukemogenic process induced by the PML-RARalpha and PLZF-RARalpha oncoproteins[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(18)：10173-10178.

23 桑奕雯.外周血细胞计数与形态学检查对常见白血病诊断的重要性[J].国际检验医学杂志，2014，35(21)：2934-2938.

24 杨红，刘建兴，周泽平，等.应用SCID和NOD/SCID小鼠构建急性髓系白血病模型成瘤率的比较[J].中国实验血液学杂志，2015，23(2)：328-334.

25 Ahn S，Park JS，Jeong SH，et al.Current routine practice and clinico-pathological characteristics associated with acute promyelocytic leukemia in Korea[J].Blood Res，2013，48(1)：31-34.

26 Lo-Coco F，Avvisati G，Vignetti M，et al.Retinoic acid and arsenic trioxide for acute promyelocytic leukemia[J].N Engl J Med，2013，369(2)：111-121.

Currentstatusoftheestablishmentofacutepromyelocyticleukemiainmousemodels

WANGYitong，XUWen

Department of Immunology，Harbin Medical University，Harbin 150086，China

Acute promyelocytic leukemia(APL)is a class of malignant disease of hematopoietic tissue.Animal models are important tools for exploring human-related diseases.Many studies have beer shown that APL mouse models can be established by transgenic，retroviral-mediated and leukemia cell transplantation.These models established by these three methods can be re-transplanted.The establishment of these models lays the foundation for understanding the pathogenesis and efficacy of APL.In order to determine whether the model is successfully established，these methods can be used for blood tests，blood smear and bone marrow smear，immunology，molecular biology and pathology related to complete the examination.Successful establishment of APL animal model can provide important experimental basis and theoretical basis for the study，development and evaluation of drug efficacy in APL，which will help people to understand human APL further.

Acute promyelocytic leukemia；Animal model；FVB/NJ mice

黑龙江省教育厅海外学人科研资助项目(1155h015)

哈尔滨医科大学免疫教研室(哈尔滨 150086)

王艺潼，女，(1991-)，硕士研究生，从事免疫学的研究。

徐雯，E-mail：wenxu2006tokyo@163.com

R733.7

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.05.013

(收稿：2017-04-11)