细菌室能力评价中考核盲样检测分析

余慧宏，魏建萍，涂智杰，胡芹，黄洁琼，宋建新

室间质量评价是由专门机构采用一系列办法，比较和评价地区间、省内或全国范围内的各实验室的检验质量。近十年来，本实验室陆续参加了不同范围室间质量评价的病原微生物检测能力考核，大多数考核方式为盲样中分离鉴定致病菌，最近一次细菌室能力评价考核，则是同时对三个类别的考核盲样进行检测，现将考核情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 样品来源 本实验室参加江西省疾病预防控制中心细菌实验室能力评价考核时，发放的考核盲样，编号为F1-F4。盲样F1需进行肠道、呼吸道病原菌检测，病原菌鉴定到种或型；盲样F2进行核酸检测，考核范围为肠道病原菌，须鉴定到属；盲样F3、F4进行血清学检测（布病）。

1.2 主要试剂和仪器 血平板、巧克力色血琼脂平板购自郑州安图生物工程股份有限公司；显色培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；其余干粉培养基均由青岛海博试剂有限公司生产；ID32E肠杆菌科生化鉴定试剂条购自法国生物梅里埃公司；沙门菌属诊断血清（60种）由宁波天润生物药业有限公司提供；核酸检测试剂盒由江苏硕世生物科技有限公司生产；虎红平板凝集抗原和试管凝集抗原由江西省疾控中心提供；法国生物梅里埃ATB细菌鉴定仪、菌液比浊仪、美国ABI 7300型荧光PCR仪。

1.3 方法 依据GB4789-2010《食品微生物学检验》[1]；WS269-2007 《布鲁氏菌病诊断标准》[2]；《霍乱防治手册》（第6版）[3]，以及《发热呼吸道症候群监测方案》、《脑炎脑膜炎症候群监测方案》、《腹泻症候群监测方案》（2012年版）进行检测。

2 检验过程及结果

2.1 F1考核盲样病原菌分离 病原菌检测分离培养平板，置于5%二氧化碳环境，36℃恒温培养24h。血平板上生长出单一的灰白色、中等大小、不溶血、湿润的菌落，未见产生金黄色、蓝绿色等色素；巧克力色血琼脂平板上生长出单一的灰白色、中等大小的菌落。

置于有氧环境，36℃恒温培养24h，麦康凯平板上生长出表面光滑、湿润、无色半透明菌落；伊红美兰平板上生长出淡红接近无色的，半透明圆形菌落；科玛嘉沙门菌显色培养基上生长出紫红色、表面湿润的圆形菌落[4]；血平板上生长的菌落与置于5%二氧化碳环境中的菌落形态一致。TCBS、庆大霉素琼脂平板接种原点处有少许菌苔，由于平板的强选择性抑制作用，未沿着接种线生长出菌落。

从每块长有菌落的平板上观察，菌落形态很一致，属于同一类型菌，从菌落大小、规则程度以及透明度上找差别，挑取血平板上多个菌落进行染色，均为无芽胞、荚膜的革兰阴性杆菌，氧化酶阴性。挑取5个菌落，接种三糖铁，培养后结果均为k/A、产气、硫化氢阳性。

经梅里埃生化分析系统（ATB）鉴定为沙门菌属，极好的鉴定（%ID：99.9 T 值：0.81）。噬菌体试验呈现出O-I噬菌体裂解，C多价、E多价噬菌体均不裂解模式。血清学鉴定均为A～F多价，O8，Hr凝集，盐水对照无自然凝集。诱导后得出血清型，为黄金海岸沙门菌（8：r：l，w）。

2.2 F2考核盲样荧光PCR检测 按试剂说明书配制霍乱弧菌；霍乱弧菌01群；霍乱弧菌0139群；霍乱弧菌CTX基因检测4种反应体系。反应条件：95℃ 5min；95℃ 10s→55℃ 40s；40 次循环。 检测霍乱弧菌0139群，待测盲样扩增曲线呈S型，且Ct值为15.76，判定为霍乱弧菌0139群核酸检测阳性。检测霍乱弧菌CTX毒力基因，Ct值为16.05，判定为霍乱弧菌CTX毒力基因检测阳性[5，6]。

盲样F2检测出带有CTX毒力基因的0139群霍乱弧菌。

2.3 F3、F4考核盲样血清学检测（布病） 虎红平板凝集试验：从编号F3、F4盲样管中，分别取0.03ml血清滴于玻片上，各加入虎红平板凝集抗原0.03ml，摇匀后，在5min内判定结果为F3盲样阴性，F4盲样阳性。

试管凝集试验：⑴将编号F3、F4盲样管中每份血清用9支小试管，第一管加2.3ml生理盐水，第二管不加，第三至第九管各加0.5ml。⑵取被检血清0.2ml，加入第一管中，混匀后，吸取1ml加入第二和第三管各0.5ml，吸取第三管混匀后的血清0.5ml加入第四管，依次稀释至第八管，混匀后，吸取0.5ml弃去。⑶从第二管至第九管，每管加入用生理盐水作1：10稀释的抗原液0.5ml混匀。第一管不加，作为血清对照。全部试验管置37℃温箱恒温22h，取出放室温2h观察结果。

F3盲样试验管，除第一管血清对照管液体清亮，其余八管液体浑浊，无凝集。F4血清的第二、三试验管完全凝集；第四管几乎完全凝集，上层液75%清亮；第五管有微量凝集，液体25%清亮；第六至第九管均液体浑浊，无凝集。

F3血清试管凝集试验为阴性，F4血清试管凝集试验为阳性，效价为1：100。

3 讨论

盲样考核是对检测人员技能、实验室内质量控制情况的一种检验[7]。须认真做好仪器设备检定和维护工作，所用培养基、诊断血清的质量控制，按要求配制、贮存培养基，按照无菌操作程序进行，对操作人员有最基本且重要的技能要求，需使用干湿适度的平板，采用恰当的划线方法接种，分出尽量多的单菌落，单个菌落过少容易造成漏检，并且难于开展纯培养。为确保营养培养基、弱选择性培养基有较好分离效果，可平行使用两块平板进行划线接种。

培养基是培养微生物的必需品，是对病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。选择考核所用培养基时，应先研读考核样品作业指导书，明确要求及考核范围，应满足样品中目的菌所需营养要求，尽量减少干扰菌的影响及快速鉴定的需要，建议选用对目的菌有明确指示作用的显色培养基。直接分离时可用血平板，其适于多数细菌的生长，接种培养后，观察菌落形态的差别，对初步判断样品中可能存在几种类型菌，有一定的参考意义，从而不易漏检。样品直接分离的平板上，仅存在单一形态菌落，也应尽量多挑取，因分属不同型别的细菌，可呈现相似菌落，不易区分，需鉴定后，证实是否存在不同型别的菌。

本次考核检测鉴定的细菌均为应急面对之细菌，分别为沙门菌、霍乱弧菌和布鲁菌。自此次盲样中分离出的沙门菌，仅出现一相鞭毛抗原，需通过位相变异试验诱导出另一未知相，才能确定其菌型。日常沙门菌鉴定工作经验得知，有些沙门菌经简易平板法多次试验才可诱导成功，这样非常耗费时间。考核往往是有时间限定的，为了能在规定时间内得出沙门菌血清型，便将简易平板法作为参考方法，同时还采用血平板-滤纸条搭桥法[8]，血平板搭桥法不仅直观，诱导后的沙门菌凝集效价高，还提前三天时间得出准确血清型。用仪器辅助鉴定时，即使明确提示为某沙门菌菌种，也应综合血清学试验结果做出菌型判定。

布鲁菌为人兽共患性疾病病原菌，可通过人体皮肤、呼吸道、消化道进入人体引起感染。过去多见于牧区，近年来散发于大中城市，随着畜牧业的发展，人、畜间布病疫情呈现增长趋势[9，10]。布鲁菌病实验室检查技术分为特异性血清学检查、分离布氏菌和PCR试验。特异性血清学检查包括虎红平板凝集试验、试管凝集试验等，虎红平板凝集试验可作为初筛试验，适于大量标本的筛查。作为唯一国际全标化诊断布病方法的试管凝集试验[11]，进行稀释操作步骤时，须做到准确吸取，充分混匀；判断抗体效价时，须认真观察、比对，试验管轻拿轻放。

总之，全面系统地掌握专业知识，更新丰富知识储备，积累总结经验[12]，拓宽思路有利于解决检测过程中遇到的问题，正确规范化操作是获取准确可靠检测结果的保障。