慢性乙型肝炎抗病毒治疗新进展

侯春艳 综述，杨永峰 审校

慢性乙型肝炎抗病毒治疗新进展

侯春艳 综述，杨永峰 审校

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒感染引起的、以肝脏炎症和坏死病变为主的一种全身性感染病。目前，治疗乙型肝炎的抗病毒药物主要包括干扰素和核苷酸类似物两类。现在正在探索开发新药及优化联合、免疫疗法或凋亡疗法（促进感染细胞凋亡）来彻底根除慢性HBV感染。

慢性乙型肝炎；抗病毒治疗；进展

乙型肝炎病毒感染是人类主要的传染病之一，目前全球已批准用于治疗慢性乙型肝炎的药物包括干扰素类（IFN）及核苷（酸）类似物（NA）。干扰素的主要作用是增强抗乙型肝炎病毒的特异性免疫应答和抗病毒蛋白，抑制HBV复制；核苷酸类似物则通过竞争性结合HBV聚合酶的逆转录酶结合位点，抑制逆转录酶活性，从而抑制病毒复制。国内外开展NA和IFN优化及联合治疗，积极研发新型NA和针对病毒复制周期和感染环节抗HBV药物。本文对近年抗乙型肝炎病毒治疗新进展进行简要介绍。

1 现有药物的优化、联和及新型核苷（酸）类似物

1.1 NA优化治疗 NA通过竞争性结合HBV聚合酶的逆转录酶结合位点，抑制逆转录酶活性，同时阻止其延长，但长期服用可引发病毒突变产生的耐药性，甚至引起更严重肝病，且治疗周期长，停药指征严格[1]。目前指南推荐选用高效、低耐药的恩替卡韦和替诺福韦酯作为一线药物。

1.2 NA+IFN序贯或联合治疗 IFN的主要作用是增强抗乙型肝炎病毒的特异性免疫应答和抗病毒蛋白，抑制HBV复制，抗肝纤维化，此类药物并不能彻底清除病毒且复发率较高，治疗效果因HBV基因型而异[2]。IFN和NA作用机制的不同决定两者可序贯或联合治疗。2015年乙型肝炎抗病毒防治指南首创根据“路线图概念”设计个体治疗新策略，强调治疗病毒早期应答的重要性。第24周应答疗效差的病人抢先干预，调整后续治疗方案（根据患者病情，加用NA/IFN序贯治疗），使耐药患者持久应答率升高。

1.3 新型核苷（酸）类似物

1.3.1 贝西福韦（besifovir） Besifor是一种新型的鸟嘌呤核苷单磷酸盐类核苷类似物，化学结构与阿德福韦相似。一项Ⅱb期临床试验比较[3]，使用Besifor 90和150 mg/d和ETV 0.5mg/d治疗96周，对初治的慢性乙型肝炎患者的疗效差异无统计学意义。该药不良反应有卡尼汀（肉毒碱）的减少，但补充卡尼汀后恢复正常。目前已进入Ⅲ期临床试验。

1.3.2 十六烷氧丙基替诺福韦酯（bexadecyloxy propyl tenofovir，CMX157） CMX157是替诺福韦前药，给药后能转化为天然脂类类似物，改善TDF口服生物利用度差特性，减少替诺福韦的血药浓度，以减少潜在的肾毒性[4]。此药Ⅰ期临床试验结果未发表，目前已进入Ⅱ期临床试验阶段。

1.3.3 替诺福韦艾拉酚胺（tenofovir alafenamide，TAF） TAF（GS-7340）是一种替诺福韦磷酸化前药。由于含有酚和丙氨酸异丙酯结构使其血浆稳定性更好，进入HBV感染的细胞后还可保持最大程度的完整性[5]。当TAF进入肝细胞后，在羧酸酯酶1（CES1）等酶的作用下转变为替诺福韦[6]，因CES1主要在感染HBV的肝细胞内表达，所以TAF治疗乙型肝炎具有一定的靶向性。1b期临床研究结果表明：TAF 25 mg的抗病毒效果与TDF300mg相当，病毒动力学结果也相似。该剂量的安全性较现在TDF安全性高，将以该剂量进行下一步临床研究[5]。目前进入Ⅲ期临床试验阶段。

1.3.4 十八烷氧乙基替诺福韦酯（octadecyl oxyethyl tenofovir，AGX-1009） 该药是替诺福韦的十八烷氧乙基单酯衍生物，也是替诺福韦前药，化学结构改变使其口服吸收率显著上升[4]。已进行Ⅰ期临床试验，试验结果尚未发表。

2 针对HBV生命周期各靶点的新药

2.1 入胞抑制剂 代表药物：Myrcludex；Cyclosporin A&B；Oxysterols。HBV入胞由细胞表面特异性分子（受体）介导，通过直接穿过细胞质膜或细胞吞噬作用而进入细胞内。HBV的宿主特性及嗜肝性与肝细胞受体有关，病毒入侵肝细胞的关键部位是表面抗原前S1区，与其特异性结合的受体是一种胆汁酸受体（钠离子牛磺胆酸共转运多肽，NTCP），NTCP与酰化的表面抗原特异性结合，为乙型肝炎及丁型肝炎的功能性受体。通过NTCP与胆汁酸底物结合，可以抑制HBV的摄取，反之NTCP与酰化HBsAg特异性结合促进HBV入胞[7]。

Myrcludex B是一种来源于HBsAg的LHBs preS1域的合成脂多糖。酰化肽氨基酸（aa）2-48 pre-S1域的L蛋白已被证明能够有效地阻止乙型肝炎病毒和丁肝病毒感染肝细胞，其机制可能是通过参与一个未知的细胞成分,最有可能是病毒受体，即促进NTCP与胆汁酸底物结合[8]。Myrcludex B已通过1期临床试验[9]。在2a期临床试验研究Myrcludex B证实HBV DNA剂量呈剂量依赖性下降，对于丁型肝炎病毒（HDV）合并感染同样有效，安全和耐受性良好。

Myrcludex（药物名）B,环孢菌素A和其他底物类似物通过NTCP抑制胆汁盐运输。因此，这些分子可能提高血清中胆汁盐和其他运送基质水平，临床需要监测。此类药物防止感染新的肝细胞,将来有希望用于联合抗病毒方案中。

2.2 抑制cccDNA形成及稳定性 cccDNA是病毒转录的模板，使HBV感染持续存在，所以目前众多新药物选择cccDNA作为作用的靶点。双链cccDNA相当稳定，到目前为止，只能通过裂解感染细胞、抑制转录因子及使cccDNA退化去除肝毒性等方法。

cccDNA转录是由大量表观遗传因素控制，包括H3和H4组蛋白，HBc和HBx蛋白，转录因子包括CREB、ATF，STAT1和STAT2，染色质修饰酶[10]。另外可通过抑制/绑定调节组蛋白乙酰化作用进而控制[11]。一些化合物可以抑制/绑定这些因素，可能被用来对抗乙型肝炎病毒，但这些因素也参与正常细胞过程中，细胞毒性是一个真正的风险。乙型肝炎病毒感染细胞培养系统（HepG2和HepAD38细胞系）最终可能用于cccDNA目标抗病毒药物的高通量筛选。目前开发药物有EML2M（抑制p300和PCAF组蛋白乙酰转移酶活性），MC2791（刺激hSirt1/2脱乙酰酶活性）和MC3119（抑制JMJD3组蛋白脱甲基酶活性）[12]。

高剂量IFN-α（500或1000 IU/ml）和中等剂量的肿瘤坏死因子超家族成员淋巴毒素D受体（LTbR）激动剂可以促进HBV感染肝细胞内cccDNA降解。其机制可能是通过上调细胞核APOBEC（载脂蛋白 B mRNA编辑酶催化多肽）3A及3B胞嘧啶核苷脱氨酶的表达，而APOBEC3A与HBV核心蛋白、cccDNA结合，最终因胞嘧啶脱氨导致cccDNA的降解，而且对人体基因组DNA并没有影响[13]。

2.3 抑制HBV基因表达 针对病毒转录和翻译过程的小分子干扰RNA【siRNA（代表药物ARC520）】，RNA干扰（RNAi）是指真核细胞针对外来的双链小RNA（dsRNA）诱发的对外来dsRNA转录的mRNA高效特异性降解现象，又称转录后基因沉默，是细胞的自我保护机制。1998年在利用外来dsRNA调节线虫基础的功能时，发现导入外源性基因未能取得想要的改变，就此首次发现真核细胞有转录后基因沉默功能[14]。基于siRNA这种沉默目标基因的特异性，而且对其他基因的作用无交叉作用，采用病毒mRNA上符合内部稳定的序列作为靶点，与活跃RNAi和其触发器连接合成并筛选出高效的siRNA片段，后期通过载体递送到感染HBV的靶细胞中，可达到沉默病毒基因的目的[15]。

RNA干扰技术发展限制包括siRNA的毒性（过量的siRNA诱发更强烈的免疫反应及导致与非目标mRNA不完全互补配对的概率增加）、脱靶效应（siRNA引起非目标基因的非特异性沉默，引起细胞的凋亡或生长抑制，考虑与非目标基因不完全互补配对所致）、免疫刺激（激活机体天然免疫系统）、传送问题（外源性siRNA导入细胞的效率很低）。现在通过选择合适剂量，化学修饰，纳米颗粒传送等方式提高其效率及安全。siRNA是很有希望的一项技术，在病毒性疾病的研究中应用广泛，前景可观[16]。

ARC-520是由一个黏附在N．乙酰葡糖胺配体上的膜溶解肽和两个靶点为HBV mRNA的小分子干扰RNA（siRNA）组成的复合物，通过日渐成熟的 DPCs（Dynamic PolyConjugates）输送系统，以mRNA为目标，现由Arrowhead公司生产，通过胆固醇靶向配体至靶细胞发挥作用。ARC-520通过成熟的输送系统人工导入细胞的dsRNA，而dsRNA作用机制目前被广泛接受的分起始阶段和效应阶段。在起始阶段，dsRNA在核酸酶（Dicer酶：核酸内切酶III家族的一员）作用下切割成21～23 nt siRNA。在效应阶段与siRNA Agohaute 2（AGO2）蛋白酶等通过复杂的组装和催化下结合，形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），随后解旋形成单链含siRNA的RISC，又称有活性的RISC。活化的RISC与目标mRNA分子依最高优先序列互补反义结合，抑制基因表达[17]。

ARC-520研究进展。前期小鼠实验证实单一注射RNAi可有效减少3-4log病毒DNA载量及病毒s、e抗原。在对黑猩猩实验上，与对照组相比，实验组HBV-DNA、HBsAg和HBeAg水平减少90%-95%。而在迄今为止到2a期的临床药物应用上没有出现任何不良反应。目前加用3mg的剂量，安全性和耐受性和前两组一样安全且效果表现良好[18]。siRNA治疗作用于cccDNA减少病毒DNA载量，但不能实现病毒的清除。免疫治疗是打破免疫耐受，调动机体免疫功能，清除病毒，但其有效作用的先决条件是减少病毒载量。故而也有建议采用联合免疫治疗[19]。

2.4 衣壳抑制剂 HBV DNA的合成是在病毒的核衣壳。核衣壳的作用包括保护HBV基因组免受降解，并介导病毒基因组的释放。乙型肝炎病毒的核壳化过程是有病毒P蛋白的前基因组RNA（pgRNA）在HBV多聚酶作用下表达核心蛋白HBcAg形成核衣壳的过程。该类药物作用于pgRNA逆转录前的衣壳化阶段，其阻碍衣壳化成熟和稳定过程，从而抑制病毒的有效复制。衣壳抑制剂目前包括heteroaryldihydropyrimidines（HAPs）和phenylpropenamides两类。HAPs诱导核心蛋白错误装配，而Phenylpropenamides类加速没有前基因组RNA和逆转录酶的空心衣壳形成，两者达到乙型肝炎病毒复制的不稳定组装。HAPs代表药物有Bay41-4109和GLS4。Phenylpropenamides代表药物是AT-61及AT-130[20-22]。

HAP类药物作用机理的最新研究显示是结合到装配过程中形成的多聚体核心蛋白，导致其错误装配，从而达到抗HBV的效果。体外实验研究证实，Bay 41-4109和GLS4能够有效地抑制一些对拉米夫定和阿德福韦耐药的HBV毒株[23]。

Phenylpropenamides阻止HBV pgRNA的核壳化、细胞核内DNA的复制和细胞外病毒颗粒的成熟，进而抑制HBV的复制[22，23]。研究显示，AT-61和AT-130不仅能抑制野生型HBV，还能抑制对拉米夫定耐药的HBV毒株[24]。

3 免疫疗法

免疫疗法包括治疗性疫苗及免疫调节剂。抑制病毒复制药物，可能在清理感染肝细胞证明并无良好效果。因此，消除cccDNA池仍然有挑战。因此包括免疫治疗方法的联合治疗可能是必要的。

3.1 免疫性疫苗 免疫性疫苗的理论基础：1、在慢性乙型肝炎携带者身上建立强大的CD4+和CD8+T细胞反应，消除被感染的肝细胞；2、诱导B细胞反应，中和病毒释放传染肝细胞，以防止现存幼稚肝细胞的再次感染[25]。免疫性疫苗包含蛋白类疫苗、DNA疫苗、其他疫苗等。

蛋白类疫苗的主要原理是将HBV衣壳蛋白经修饰后接种给患者，诱发较强的特异性细胞免疫，激活B淋巴细胞和CD4T细胞应答。目前研究热点有亚单位疫苗、抗原抗体复合物疫苗和基于表位的多肽疫苗。包括ClaxoSmithKIine生物公司（重组HBsAg与AS02B液体佐剂）、NASVAC（HBs蛋白和HBe蛋白连用）。乙型肝炎表面抗原抗体复合物疫苗是由适当比例的HBsAg-HBIG组成的复合物，抗原呈递细胞（APC）吸收后通过FC受体，将HBsAg有效递呈给T细胞使机体对乙型肝炎病毒有效反应[26]。目前实验以HBsAg-HBIG复合物用明矾作为佐剂免疫原性复杂（YIC）测试：三期临床试验的450名慢性乙型肝炎病毒是无效的，实验组经过12针注射只有14.0%的血清转化，对照组明矾单独注射实现21.9%血清转化。III期临床实验失败，考虑使用疫苗过度刺激，机体免疫疲劳反而导致其有效性下降。而多次注射明矾可能刺激炎症反应和先天免疫反应导致其治疗效果，具体不详[27]。

DNA疫苗是将HBV抗原蛋白的相应DNA序列重组成为真核表达质粒，导入机体后不断产生质粒编码抗原，诱导机体产生免疫反应。其能够诱发Th1型细胞介导CTL细胞毒反应，而且该疫苗生产相对简单且成本低，但导入质粒表达水平低仍是重大问题。目前有巴斯德所研发的pCMV—s2．S表达载体DNA疫苗、韩国浦项（Pohang）科技大学开发HBl00 DNA疫苗、Oxxon Therapeutics Ltd开发的安卡拉痘病毒载体DNA疫苗。目前通过体内电穿孔的质粒DNA（EP），大大提高疫苗诱导能力[28]。然而目前有研究结果显示DNA疫苗并没有明显改善特异性T淋巴细胞应答及抗病毒疗效，其作用效果与患者一般状况、肝病严重程度、HBV感染阶段、甚至HBV DNA水平、以前的治疗等多方面有关[29]。

其他治疗性疫苗。GS4774，重组酵母疫苗表达乙型肝炎病毒S，核心，HBx融合蛋白。研究在健康的志愿者表示，三个剂量的10个酵母单位每月给耐受性良好，引起HBV特异免疫反应[30]。

3.2 免疫调节剂 免疫调节剂包括模式识别受体Toll样受体激动剂（TLRS）、PD1和其他共抑制阻滞剂、HBV特异性修改T细胞。

TLRS。模式识别受体Toll样受体激动剂（TLRS）是促进慢性乙型肝炎病毒患者建立足够的HBV特异性免疫应答一个重要环节。该受体为病原识别受体，激活自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞的启动，限制感染扩散、促进先后天性免疫应答[31]。在黑猩猩实验中发现口服的toll样受体激动剂receptor-7（gs -9620）有长期抑制乙型肝炎病毒慢性感染作用。在为期十周的治疗中，发现HBV-DNA定量下降2.2 log水平，而于肝细胞活检发现HBsAg、HBeAg水平下降，且乙型肝炎病毒感染肝细胞数量下降[32]。

PD1（Programmed Death-1）和其他共抑制阻滞剂。因为乙型肝炎病毒持久性、病毒控制被解释为T细胞疲惫的结果。PD1与CTLA-4一样（与B7家族结合）作为T细胞活化协同刺激（第二）信号的阴性选择，即抑制T细胞活化。而且PD1和PDL1（存在肿瘤细胞表面）结合后是肿瘤发生免疫逃逸机制的一部分。通过封锁PD1可提高第二信号阳性选择，促进T细胞活化及提高肿瘤细胞的免疫。PD1单克隆抗体是以PD1为抗原的人工生产的特异性抗体，与PD1特异性结合，封锁PD1功能。PD1单克隆抗体作为抗癌明星，有研究提示在癌症治疗领域通过PD1封锁恢复T细胞活化及提高抗肿瘤免疫力，延长肿瘤病人的生存期[33]。在土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck Hpatitis Virus）感染旱濑的模型中，采用恩替卡韦抗病毒28周，于12周加用DNA疫苗（WHcAg-WHsAg复合物）联合治疗到24周，加PDL1单克隆抗体三针，与其他三组比较，三联疗法治疗有效增强T细胞特异性免疫和抑制病毒复制[34]。在该实验发现单用PDL1单克隆抗体没有任何增强T细胞特异性免疫和抑制病毒复制的能力，具体机制不详。

HBV特异性T细胞免疫。这种治疗方法旨在提供转基因T细胞和消除HBV感染的肝细胞。目前技术来说，个体差异及受体配体的免疫排他性可能限制这种方法的临床应用，而且该法的安全性也受到质疑。新兴技术的嵌合抗原受体（CAR）能生成一个细胞外表达的嵌合受体。对于乙型肝炎病毒，目标可能是细胞表面的HBsAg和高亲和性anti-HBs的单链可变片段。即通过将识别乙型肝炎表面蛋白和胞内信号域（免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）在体外进行基因重组,生成重组质粒,再通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达乙型肝炎表面蛋白受体，转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，称之为嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）[35]。HBV感染CAR-T细胞的肝细胞可以触发增殖或激活信号启动有效T细胞反应。这种策略被应用于乙型肝炎病毒动物模型，但该法存在脱靶效应（见前RNAi解释），需要严密细胞毒性，能否实现CHB患者的病毒清除还有待观察[36]。

4 Birinapant

Birinapant是一种SMAC（second mitochondria-derived activator of caspases）模拟拮抗剂，拮抗cIAP作用，对cIAP1最有效，能刺激和恢复抗病毒免疫，以根除慢性HBV感染。凋亡抑制因子（IAPs）是一类高度保守的内源性抗细胞凋亡因子家族，主要通过抑制Caspase活性和参与调解核因子NF-κB的作用而抑制细胞凋亡。在科学家采用慢性HBV感染免疫功能正常的小鼠模型中明确细胞凋亡抑制蛋白（cIAPs）抑制TNF信号在乙型肝炎感染，其限制感染肝细胞死亡，从而使病毒持续存在。同时相关数据表示拮抗cIAPs功能可促进HBV感染的细胞死亡，促进清除[37]。

目前有研究提示合成和天然（Smac和Grim）IAP拮抗剂通过cIAP1拮抗作用杀死敏感肿瘤细胞，导致NF-kB激活，使 TNFa生产和通过增强 TNF-R1杀死肿瘤细胞[38]。Birinapant清除感染的机制是减少老鼠的不能应对乙型肝炎病毒CD4+T细胞及促进TNF生成及他们的化学作用。乙型肝炎病毒感染的动物实验中，与恩替卡韦联用，birinapant促进HBsAg的清除和获得HBsAb，并能够提高抗病毒核苷模拟，以减少病毒DNA产量。该药通过促进感染肝细胞的死亡，从而清除在肝脏的储藏的乙型肝炎病毒DNA，促进消除病毒[39]。该药对细胞特异性选择方面目前没有证据，在剂量递增阶段IB/IIA乙型肝炎试验birinapant在第一次给药组观察出现后颅神经麻痹。该严重的安全问题迫使国内停止在I期乙型肝炎的药物试验招生。

5 结语与展望

近年来对乙型肝炎的发病机制和病理认识的不断深入，治疗更全面，目前治疗多着重于HBV生命周期阶段的清除，免疫疗法，新技术支持治疗方面。在未来五到十年里，功能性治疗乙型肝炎将不是人类遥远的梦想。

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（收稿：2016-03-25）

（本文编辑：朱传龙）

Antiviral therapy for chronic hepatitis B

Hou Chunyan，Yang Yongfeng.Department of Liver Diseases,Nanjing Second Hospital，Medical School，Affiliated to Southeast University，Nanjing 210009，Jiangsu Province，China

Chronic hepatitis B is caused by hepatitis B viral infection.It is a systemic infections mainly including inflammation and necrosis lesions of liver.At present，antiviral drugs to treat hepatitis B mainly include two categories，e.g.interferon and nucleotide analogues.Now，scholars are exploiting new agents，the optimization of combination therapy，immune or apoptosis therapy to eradicate chronic HBV infection.

Chronic hepatitis B；Antiviral therapy；Progress

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.01.035

210000南京市 东南大学医学院感染病学研究生（侯春艳）；附属第二医院肝病科（杨永峰）

侯春艳，女，25岁，硕士研究生，主要从事病毒性肝炎等肝脏病防治研究

杨永峰 E-mail：yyf1997@163.com