肝癌组织中CUL4A的表达及其对肝癌细胞生长的影响

郑春雷，鲍红光，高红

（1.齐齐哈尔医学院附属第二医院 肿瘤外科， 黑龙江 齐齐哈尔 16100；2.黑龙江省齐齐哈尔市第二医院 外科， 黑龙江齐齐哈尔 161006）

泛素-蛋白酶系统能够降解蛋白质，具有重要的生物学功能，泛素-蛋白酶系统参与细胞增殖、分化和细胞凋亡，参与炎症反应，具有递呈抗原、转录调控等生命活动，泛素连接酶E3在癌症的发生发展中具有重要作用，Cullin家族高度保守，属于E3连接酶，CUL4A是其家族成员之一，CUL4A的结构和功能与泛素连接酶Cullin 4B（Ubiquitin ligase Cullin 4B，CUL4B）比较相似，通过和DNA损伤蛋白、ROC1环指蛋白结合形成泛素连接酶复合物，发挥降解底物蛋白的作用[1-2]。CUL4A在乳腺癌、鳞状细胞癌、恶性胸膜间质瘤等多种肿瘤中呈高表达[3-5]，也有研究[6]发现CUL4A在肝癌中也呈高表达，但CUL4A在肝癌发生发展中的生物学作用尚不十分明确，本研究对肝癌组织中CUL4A的表达情况进行研究，并研究CUL4A对肝癌细胞生长的影响，探讨CUL4A在肝癌发生发展中的作用。

1　资料与方法

1.1　研究对象

选择2013年1月—2015年12月齐齐哈尔医学院病理中心72例肝癌术后肝癌组织标本及其癌旁组织（距离肝癌组织5 cm以上）标本和72例肝血管瘤术后正常肝组织标本做为研究对象，所有肝癌患者术前未进行过放化疗等治疗，首次进行手术治疗。所有研究对象均签署知情同意书，均经齐齐哈尔医学院附属第二医院伦理委员会批准。

1.2　细胞及主要试剂

实验前对正常肝细胞和Hep-G2、QSG-7701肝癌细胞株中CUL4A的表达情况进行检测，CUL4A在正常肝细胞中表达水平低，在Hep-G2、QSG-7701肝癌细胞株中呈较高表达，因此选择Hep-G2和QSG-7701肝癌细胞株进行研究，细胞株均购自上海中科院细胞所。试剂： CUL4A siRNA（美国sigma公司），胰蛋白酶、胎牛血清（北京索莱宝科技有限公司），抗CUL4A抗体、抗β-actin抗体（CST公司）等。

1.3　方法

1.3.1临床资料收集收集72例肝癌患者的年龄、性别及临床病理等资料。

1.3.2检测CUL4A的表达采用免疫组化法检测肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中CUL4A的表达情况。免疫组化结果评分：根据免疫组化染色范围和强度进行评分：染色范围：染色范围为0%为0分，染色范围为1%～25%为1分，染色范围为26%～50%为2分，染色范围为51%～75%为3分，染色范围为76%～100%为4分；染色强度：染色阴性为0分，染色弱阳性为1分，染色阳性为2分，染色强阳性为3～4分。免疫组化评分为染色范围和染色强度相乘。

1.3.3细胞增殖实验将对数生长的Hep-G2和QSG-7701肝癌细胞接种到96孔板中，用CUL4A-siRNA转染肝癌细胞，并以NC-siRNA做为对照，转染后继续培养，转染24 h后吸出培养基，加入CCK混合液孵育，酶标仪测定波长450nm的OD值，每天同一时间进行检测，连续监测7 d。

1.3.4细胞周期监测将对数生长的Hep-G2和QSG-7701肝癌细胞接种到12孔板中培养，待肝癌细胞达85%以上融合时，用CUL4A-siRNA转染肝癌细胞，并以NC-siRNA做为对照，转染48 h后胰蛋白酶消化并收集细胞，进行PI染色，流式细胞仪检测肝癌细胞周期。

1.3.5侵袭实验在24孔板中加入RPMI1640培养液，孔上置入处理过的铺有Matrigel基质胶的小室，将CUL4A-siRNA 和NC-siRNA转染的Hep-G2和QSG-7701肝癌细胞悬液加入小室的上室中培养48 h，取出小室加入甲醇固定，加入结晶紫染液染色，高倍显微镜下拍照并观察穿膜细胞数。

1.3.6迁移实验小室中不铺Matrigel基质胶，细胞接种培养后12 h进行染色，其余步骤同侵袭实验。

1.4　统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行分析，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析，相关性研究采用Spearman相关分析，取P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1　CUL4A在肝癌组织中的表达

肝癌组织中CUL4 A的免疫组化评分（7.64±2.47）分明显高于癌旁组织（1.23±0.36）分和正常肝组织（0.87±0.12）分（P=0.000）；癌旁组织和正常肝组织中CUL4A的表达无统计学差异（P＞0.05）（图1）。

图1　CUL4A的不同肝组织中的表达情况（×200）　A：肝癌组织；B ：癌旁组织；C ：正常肝组织

2.2　CUL4A与肝癌临床病理特点的关系

肝癌组织中CUL4 A的表达与肝癌的分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、T N M分级有关（P＜0.05），与患者的年龄和性别无关（P＞0.05）；低分化程度肝癌组织中CUL4A的表达明显高于中/高分化肝癌组织（P＜0.05），肝癌直径＞5 cm肝癌组织中CUL4A的表达高于直径≤5 cm肝癌组织（P＜0.05），有淋巴结转移肝癌组织中CUL4A的表达高于无淋巴结转移者（P＜0.05），TNM分级III级肝癌组织中CUL4A的表达高于I～II级（P＜0.05）（表1）。

表1　CUL4A的表达与肝癌临床病理特点的关系

2.3　CUL4A对肝癌细胞生长能力的影响

转染CUL4A-siRNA的Hep-G2肝癌细胞株在3 d和7 d时的OD值明显低于NC-siRNA组（P＜0.05）（表2）；转染CUL4A-siRNA的QSG-7701肝癌细胞株在3 d和7 d时的OD值明显低于NC-siRNA组（P＜0.05）（表3）。

2.4　CUL4A对肝癌细胞生长周期的影响

转染CUL4A-siRNA的Hep-G2肝癌细胞株S期细胞比例低于NC-siRNA组（P＜0.05）（表4）；转染CUL4A-siRNA的QSG-7701肝癌细胞株S期细胞比例低于NC-siRNA组（P＜0.05）（表5）。

表2　CUL4A对Hep-G2肝癌细胞株增殖的影响

表3　CUL4A对QSG-7701肝癌细胞株增殖的影响

表4　CUL4A对Hep-G2肝癌细胞株生长周期的影响

表5　CUL4A对QSG-7701肝癌细胞株生长周期的影响

2.5　CUL4A对肝癌细胞侵袭转移的影响

转染CUL4A-siRNA的Hep-G2肝癌细胞株侵袭转移能力低于NC-siRNA组（P＜0.05）（图2）；转染CUL4A-siRNA的QSG-7701肝癌细胞株侵袭转移能力低于NC-siRNA组（P＜0.05）（图3）。

图2　CUL4A对Hep-G2肝癌细胞株侵袭迁移的影响　A：CUL4A-siRNA侵袭；B：NC-siRNA侵袭；C：CUL4A-siRNA迁移；D：NC-siRNA迁移

图3　CUL4A对QSG-7701肝癌细胞株侵袭迁移的影响　A：CUL4A-siRNA侵袭；B：NC-siRNA侵袭；C：CUL4A-siRNA迁移；D：NC-siRNA迁移

3　讨　论

CUL4A属于通过泛素化调节蛋白质的降解，Cullin家族成员[7]，是最大类的E3泛素连接酶，CUL4A能够调节粒细胞的分化，能够调节造血干细胞的分化和增殖，与肿瘤的发生发展关系密切[8-9]。在乳腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、鳞状细胞癌等多种肿瘤中呈高表达[10-12]，被推断为是癌基因，CUL4A可以激活E2F1的活性，对损伤的DNA进行修复；CUL4A还可以修饰p27、p21、p53等蛋白使细胞周期停滞，抑制细胞增殖，CUL4A 能够通过MDM2对P53进行调节，CUL4A表达的升高能够降解P53，从而促进恶性肿瘤的发生[13-20]。

王允山等[5]发现CUL4A在乳腺癌的侵袭转移中发挥重要作用；李振宇[10]发现CUL4A在结肠癌中异常表达，并和结肠癌的转移和进展关系密切；韩小妮等[13]发现CUL4A在卵巢癌中异常表达，促进卵巢癌的侵袭和转移。有研究[6]发现CUL4A在正常肝组织中低表达，在肝癌组织中为高表达，但CUL4A在肝癌发生发展中的具体机制尚不清楚，CUL4A是否也影响肝癌细胞的生长？是否影响肝癌细胞的侵袭和转移？本研究对肝癌组织中CUL4A的表达情况进行研究，并探讨CUL4A对肝癌细胞生长的影响，结果发现：肝癌组织中CUL4A的表达明显高于癌旁组织和正常肝组织。肝癌组织中CUL4A的表达和肝癌的分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分级有关。转染CUL4A-siRNA的Hep-G2、QSG-7701肝癌细胞株在3 d和7 d时的OD值明显高于NC-siRNA组。转染CUL4A-siRNA的Hep-G2、QSG-7701肝癌细胞株S期细胞比例低于NC-siRNA组。转染CUL4A-siRNA的Hep-G2、QSG-7701肝癌细胞株侵袭转移能力低于NC-siRNA组。本研究结果证实了CUL4A在肝癌组织中呈高表达，CUL4A的高表达和肝癌的临床病理特点关系密切，Hep-G2和QSG-7701肝癌细胞株中CUL4A下调后细胞的增殖受到抑制、S期细胞比例降低、侵袭转移能力下降，表明CUL4A可以促进肝癌细胞的生长、影响肝癌细胞周期，促进肝癌细胞的侵袭转移能力。CUL4A在肝癌中发挥促癌基因的作用，CUL4A促进肝癌细胞增殖，影响肝癌细胞周期以及促进侵袭转移能力的机制有待进一步研究，可能与CUL4A修复损伤的DNA，修饰p27、p21、p53等蛋白阻止细胞周期从而抑制细胞增殖，CUL4A 和P53关系密切，CUL4A高表达可以降解P53，从而影响肝癌细胞的生物学特性[21-25]。

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