高速逆流色谱分离纯化脂肪酸的研究进展

荣 辉,吴兵兵,2,杨贤庆,*,李来好，3,邓建朝,李春生

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,国家水产品加工技术研发中心,农业部水产品加工重点实验室,广东广州 510300;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306；3.广东省渔业生态环境重点实验室，广东广州 510300)



高速逆流色谱分离纯化脂肪酸的研究进展

荣 辉1,吴兵兵1,2,杨贤庆1,*,李来好1，3,邓建朝1,李春生1

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,国家水产品加工技术研发中心,农业部水产品加工重点实验室,广东广州 510300;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306；3.广东省渔业生态环境重点实验室，广东广州 510300)

高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography HSCCC)是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术,在中药、生化、食品、天然产物化学、环境分析领域中有着广泛的应用。文章对高速逆流色谱技术的原理和特点,以及在微藻油、鱼油以及其他来源的脂肪酸及其相应酯的分离纯化上的应用进行了概述,并且展望了利用高速逆流色谱技术分离纯化脂肪酸的应用前景。

高速逆流色谱,脂肪酸,检测分析,分离纯化

上世纪八十年代初,美国Ito教授发明了高速逆流色谱(High-speed countercurrent chromatography,HSCCC)[1-2],很快HSCCC便被广泛应用在生物化学、医药学、食品、地质、环境、农业、材料、化工、海洋生物等众多领域。近年来随着仪器设备的不断改进和完善,HSCCC设备的保留能力和分离性能都极大的提高,使其可以使用双水相体系进行生物大分子的分离纯化,如蛋白质、核酸、脂肪酸等[3-5]。脂肪酸是人体必不可少的营养成分之一,对人体的健康具有十分重要的作用。其中ω-3和ω-6系多不饱和脂肪酸在脂蛋白平衡、抗心血管疾病、促进生长发育以及保护神经细胞等方面起着重要的作用,成为当前的营养生化以及保健品行业的研究热点[6-7]。本文就高速逆流色谱技术在脂肪酸分离和纯化方面的进展进行讨论,并展望了其发展趋势。

1 HSCCC的工作原理和技术优势

1.1 HSCCC的原理

HSCCC分离原理是螺旋柱在高速行星式运动时会产生巨大的不对称离心力,利用不对称离心力使互不相溶的两相液体在螺旋柱中不断混合,其中一相(固定相)保留下来,另一相(流动相)通过恒流泵持续不断输入,此时在螺旋柱中任何一部分,两相溶剂都反复进行着混合和不断分配的过程,这一过程频率极高,流动相不断穿过固定相,溶质(样品)随着流动相进入螺旋柱并不断反复穿过固定相,样品在两相之间不断的反复分配,由于样品中各组分在两相之中的分配能力不同,导致在色谱柱中的移动速度不一样,从而使样品中的各组分得到分离[8-9]。

1.2 HSCCC的技术优点

HSSCCC以液体溶剂做固定相,物质的分离依据其在互不相溶的两相液体中的分配系数的差异而实现,因而可以拥有广泛的溶剂来源。特点主要有以下几点:操作简单易行。HSCCC简化了样品预处理工作,能够直接进样,部分洗脱组分纯度可以达到90%以上[10],出峰可以在线检测,并且可以直接和质谱仪或红外色谱仪联用进行分析;不需要固体支持物作为固定相。由于不使用固体支持物,可以避免样品出现不可逆吸附、污染、变性、失活等;节省成本。HSCCC分离过程不是吸附与淋洗的过程,而是对流穿透的过程,可以节省填料的费用,节约溶剂的消耗;应用范围广。HSCCC所使用的两相溶剂体系是任意的,可以适用于各种极性范围的化合物的分离,不同的型号可以实现小规模的分析及大规模的制备[11]。

2 脂肪酸传统分离纯化方法存在的问题

2.1 脂肪酸的种类及功能

脂肪酸是组成油脂的脂肪族一元羧酸,根据其饱和度的不同,可以将脂肪酸分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。不同脂肪酸之间的区别主要是在于烃链的长短、饱和与否以及双键的数目和位置等。饱和脂肪酸包括辛酸、丁酸、硬脂酸、月桂酸、棕榈酸、花生酸等。研究表明,饱和脂肪酸是心脏优先动用的脂肪酸[12],适量食用饱和脂肪酸也可以促进脂肪代谢,其中辛酸等可以调节血清中低密度脂蛋白(LDL)的代谢,丁酸可以促进细胞分化和凋亡、抑制肿瘤生长的作用[13]。膳食中的饱和脂肪酸比较容易沉积在动脉管壁,过量食用会造成体内脂肪沉积,诱发高血脂和血管硬化等疾病。单不饱和脂肪酸指含有一个双键脂肪酸,主要有油酸、芥酸、棕榈油酸、蓖麻油酸等。油酸(C18∶1,ω9)是单不饱和脂肪酸最具代表性的一类,被广泛应用于食品与医药工业中。单不饱和脂肪酸具有降血糖、调节血脂、降低胆固醇等生理作用[14]。多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs),又被称为多烯酸,是指含有两个或更多个不饱和双键结构的脂肪酸。多不饱和脂肪酸根据甲基端第一个双键位置的不同,PUFAs可以分为ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列。ω-3系主要有α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等;ω-6系列主要有亚油酸(LA)、γ-亚油酸(GLA)、花生四烯酸(AA)等;ω-7、ω-9系列主要有二十碳三烯酸等[15]。多不饱和脂肪酸是人体必需的营养物质,具有保障人体细胞的正常生理功能、降低血液中的胆固醇和甘油三酯、改善血液循环等众多功能。其中ω-3系的DHA和EPA对于神经系统具有重要功能,可以促进婴幼儿脑细胞的生长发育,提高青少年记忆力,预防老年性痴呆等[16-18]。

2.2 传统脂肪酸的检测及分离纯化方法

随着人们对脂肪酸的研究的不断深入以及各种层析、色谱技术的不断出现,对于脂肪酸的检测分析以及分离提纯的方法也越来越多。常见的脂肪酸的分析测定方法有气相色谱法[19](Gas chromatography,GC)、高效液相色谱法[20](High performance liquid chromatography,HPLC)、近红外光谱法[21](Near-infrared Reflectance Spectroscopy,NIRS)等。常用的脂肪酸分离提纯方法有溶剂萃取法、低温结晶法、尿素包合法、分子蒸馏法、高效液相色谱法、超临界二氧化碳萃取法、三步提取法、脂肪酶浓缩法等。常见的脂肪酸的检测分析以及分离提纯方法都有一定的缺点。检测分析方法中HPLC的清洗过程的步骤冗长且繁琐,分离时间较长,对于某些具有生物活性的PUFAs的分离效果不好[22];分离提纯方法中分子蒸馏、超临界萃取等较新型的分离技术由于设备投资大、处理量小,使其应用受到了一定限制,更多的是用来从鱼油中分离DHA、EPA等经济价值更高的物质;三步法主要是用来提取不饱和脂肪酸如DHA等,而且操作繁杂、工艺冗长等。Rupani[23]等采用了4种市售的脂肪酶-褶皱假丝酵母脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、荧光假单胞菌脂肪酶和米黑根毛霉脂肪酶对脂肪酶浓缩法提取α-亚麻酸进行了研究。结果表明,只有褶皱假丝酵母脂肪酶这一种酶能选择性地水解亚麻籽油得到富集的α-亚麻酸。Mendes[24]等研究利用超临界二氧化碳萃取法从节旋藻油中提取亚麻酸(GLA)。在60 ℃和350 Pa的压力下,运用超临界萃取技术最终得到棕榈酸(31.7%)、棕榈油酸(12.4%)、硬脂酸(0.6%)、油酸(1.2%)、亚油酸(18.6%)、亚麻酸(35.5%)。目前人们为了进一步提高脂肪酸提取物的纯度,一般是将几种方法结合起来使用。A.Robles Medina和Cartens M等研究提出了三步法提取PUFA[25]。首先利用直接皂化法从细胞中提取脂肪酸组分,然后用尿素结晶法对不饱和脂肪酸进行浓缩,最后利用高压液相色谱进行EPA和DHA的分离纯化,获得的EPA和DHA的纯度均高达92%以上,产率分别为84%和88%。

3 HSCCC分离纯化脂肪酸的研究与应用

3.1 HSCCC分离纯化脂肪酸的发展历程

由于传统的分离纯化脂肪酸的方法有一定的缺陷,所以人们不断地寻找新的技术方法来分离纯化脂肪酸。Cao[26]等采用超临界萃取结合HSCCC分离的方法对葡萄籽中的油脂成分进行了成功的分离,得到了纯度达99%的亚油酸,这说明HSCCC是一种很有效的分离脂肪酸类化合物的方法,随后人们对此进行了更深入的研究。孙磊[27]等人应用HSCCC技术对共轭亚油酸(CLA)及其异构体的分离进行了研究。采用正己烷-乙腈(1∶1)的溶剂系统对CLA进行分离。结果表明,20 min时油酸(RT 7.10)含量为46.36%,共轭亚油酸(RT 8.03,8.23,8.71,9.11)的含量为47.63%。而38、48 min的图谱中,已经没有了油酸峰,而且共轭亚油酸的比例分别高达97.05%和97.73%,由此可见使用HSCCC可以对CLA进行较高效率的纯化。Chen[28]等对HSCCC纯化表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)单脂肪酸酯进行了研究,首先对没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯用十六烷酰氯进行催化酯化反应,再使用由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)组成的溶剂系统,通过HSCCC从该反应产物中纯化得到EGCG单脂肪酸酯,并通过红外光谱法和电喷雾质谱法对其结构进行了验证,最终确定其为EGCG-COOC15H31,HSCCC分离该物质的纯度可达到85%。

3.2 HSCCC分离纯化脂肪酸的应用

目前HSCCC分离提纯脂肪酸的相关研究,多集中在以鱼油以及微藻油为原料来分离提纯多不饱和脂肪酸上。在微藻油以及鱼油中,多不饱和脂肪酸多以甘油三酯的形式存在。目前的处理方法大多是将微藻油以及鱼油经皂化处理,成为游离脂肪酸和甘油,再经HSCCC处理就可以分离出游离的脂肪酸。应用HSCCC分离提纯脂肪酸酯时,不需进行皂化处理,就可以直接进行分离提纯。

3.2.1 HSCCC分离纯化微藻油脂肪酸 微藻是一类在陆地、海洋分布广泛、营养丰富、种类繁多的单细胞真核生物。微藻多富含蛋白质、脂肪、糖以及氨基酸和多不饱和脂肪酸等多种营养物质,是生产食品、药品高价值生物活性物质和生物柴油的重要来源[29-30]。大多微藻油脂的基本成分与植物油成分相似,但多富含多不饱和脂肪酸[31-32],而多不饱和脂肪酸是人体必需的营养物质,具有十分重要的作用。部分微藻因其可进行高密度异养发酵培养,是工业化生产富含多不饱和脂肪酸微藻油的优质来源,如裂壶藻、隐甲藻等。微藻油中脂肪酸的分离提取也愈发成为人们的研究热点[33-34]。Simon[35]等利用HSCCC和气质联用技术(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer-computer GC-MS)分离提纯亚历山大藻的脂肪酸。首先将收获的藻油进行酯交换,然后利用HSCCC进行分析。结果表明,在未分级样品中HSCCC能够分离提纯出20种含量较高的脂肪酸如豆蔻酸,棕榈酸,油酸,α-亚麻酸,EPA和芥酸等;此外HSCCC还能够分离提纯出另外22种含量约占总脂肪酸0.01%～0.2%间的微量脂肪酸,包括几种支链脂肪酸以及几乎没有报道过的脂肪酸,如18∶2-4,9。Lu[36]等利用HSCCC分离纯化ThraustochytriumATCC 26185中的角鲨烯。用有机溶剂萃取藻油,然后应用HSCCC进一步分离纯化角鲨烯,采用正己烷-乙醇(2∶1)的溶剂系统进行分离纯化。结果表明,该方法可从150 mg粗角鲨烯(0.14%)得到0.2 mg角鲨烯,纯度为96%,回收率为95%。荣辉[37]等采用HSCCC与蒸发光检测器联用技术分离纯化微小小球藻Chlorellaminutissima中的EPA。采用乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇(5∶4∶1∶1)的两相溶剂系统进行分离。结果表明,最佳的条件为流速3.0 mL/min,转速913 r/min,分离温度21 ℃。EPA的纯度高达90%以上。说明利用HSCCC分离纯化微藻油中的脂肪酸是一个十分有效的方法。

3.2.2 HSCCC分离纯化鱼油脂肪酸 鱼油是鱼体内的全部油类物质的统称,包括体油、肝油和脑油,大多从多脂鱼类中提取获得,鱼油富含ω-3系多不饱和脂肪酸,是EPA和DHA的主要来源。Li[38]等研究通过HSCCC从酯交换鱼油中分离纯化出十六碳四烯酸脂肪酸(16∶4n-1)甲酯,采用正己烷-甲醇-水(350∶175∶2)的溶剂系统来进行分离纯化。结果表明,鱼油中的大多数脂肪酸为多不饱和脂肪酸。HSCCC可以很好地分离6、9、12、15十六碳四烯酸脂肪酸(16∶4n-1)甲酯。其中15～18 min中脂肪酸的分离纯度高达78%。Brodier[39]等通过GC-MS和HSCCC对深海鲨鱼(叶鳞刺鲨)的肝油进行脂肪酸甲酯的表征和纯化。结果表明,鱼肝油可皂化的脂肪酸主要由14～24个碳原子的线性饱和和线性单不饱和脂肪酸组成。只有二十二碳六烯酸这一多不饱和脂肪酸被识别和纯化。该研究表明HSCCC是一种从鱼油中分离提纯脂肪酸的有效方法。

3.2.3 HSCCC分离纯化其他来源脂肪酸及脂肪酸酯 HSCCC除了可应用于鱼油和微藻油脂肪酸分离纯化外,人们还不断拓展,将HSCCC应用到其他来源脂肪酸以及脂肪酸酯的分离纯化中。Cao[26]等对HSCCC分离纯化葡萄籽油油脂成分进行了研究。首先采用超临界萃取的方法对葡萄籽油进行了提取,并经过皂化后,选用正庚烷-乙腈-冰乙酸-甲醇(4∶5∶1∶1)的两相有机溶剂系统,利用HSCCC对葡萄籽油可皂化物中的几种脂肪酸进行分离。因脂肪酸无紫外吸收,Cao采用了蒸发光散射检测器进行监测。结果表明1.0 g油可以分离产生约430 mg纯度为99%的亚油酸,而油酸、棕榈酸以及硬脂酸所占比例不高,同时有少量的γ-亚麻酸分离出来。Sun[40]等研究通过HSCCC从长松萝松萝酸中分离纯化脂肪酸,采用聚对苯二甲酸乙二醇酯-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7)作为两相溶剂制备体系,分离纯化获得纯度为95.7%的己酸。

HSCCC技术除了可以用来分离提纯游离脂肪酸外,还可以应用到其他的脂肪酸酯的分离纯化中。曾慧英[41]等研究利用HSCCC分离提纯葵花油氧化产物中的三亚油酸甘油酯单氢过氧化物。采用正己烷-二氯-甲烷-乙腈(4∶1∶3)的溶剂系统来进行分离纯化。结果表明,在流速1.5 mL/min、转速850 r/min、上样5 g、分离时间195 min的条件下所得的三亚油酸甘油酯单氢过氧化物纯度为96.3%,产率为52.3%。没食子酸亦称“五倍子酸”,学名“3,4,5-三羟基苯甲酸”,分子式C7H6O5,广泛存在于掌叶大黄、大叶桉、山茱萸等植物中,在食品、生物、医药、化工等领域有广泛的应用[42]。李忠琴[43]等研究通过HSCCC分离纯化中药诃子中的没食子酸,采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶1∶5)为两相溶剂制备体系。结果表明,主机转速850 r/min、流动相流速2 mL/min、检测波长254 nm的条件下,没食子酸的分离纯度可以达到96.04%。陈平[44]对HSCCC分离制备EGCG单脂肪酸酯进行了研究,并申请了发明专利。采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1∶1∶2∶1),分离纯度可以达到95%以上。上述相关研究表明HSCCC简便、快速、重复性好,同样适用于脂肪酸酯的分离纯化。

4 展望

尽管目前HSCCC已经实现了上百毫克甚至数十克的制备分离,但离数百克甚至数公斤级的制备分离还相距甚远,需要解决仪器放大过程中的关键性问题[45];同时分离柱本身的分离理论塔板数很低,因此在手性分离中的应用范围不广[46]。HSCCC需要经过多次实验才可以筛选出合适的溶剂系统,溶剂消耗量大,灵敏度不高。但HSCCC具有易放大、操作简便、成本低廉等优势;相比较其他的色谱分离方法,HSCCC由于采用液体溶剂做固定相,在高纯度目标成分的分离纯化和制备方面具有巨大的优势。在分析化学的基础上,人们不断进行研究,开发出了双向逆流色谱以及pH-区带精制逆流色谱等技术,其中双向逆流色谱具有能同时实现正向和反向两种模式的分离,分离纯化后所得的物质纯度高的优点;pH-区带精制逆流色谱具有进样量高、分离纯化后所得的物质纯度高、溶剂系统的优化较为容易的优点。总之,随着液相色谱理论研究的不断深入以及技术的不断发展,HSCCC在脂肪酸等生物大分子的分离纯化领域将发挥越来越重要的作用。

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Research progress in separation and purification of fatty acidsby high-speed countercurrent chromatography

RONG Hui1,WU Bing-bing1,2,YANG Xian-qing1,*,LI Lai-hao1,3,DENG Jian-chao1,LI Chun-sheng1

(1.Key Lab of Aquatie Product Processing,Ministry of Agriculture,National Research and Development Center for AquaticProduct Processing,South China Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510300,China;2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology Environment,Guangzhou 510300,China)

High-speed countercurrent chromatography(HSCCC)is a kind of liquid-liquid partition chromatography,which has the unique features of high efficiency and continuous processing capability. It has been widely used in the separation and purification of Chinese heabal medicines,the natural products and food,as well as in biochemistry and in environmental chemistry analysis. In this paper,the principle and characterization of high-speed countercurrent chromatography and its application in separation and purification of fatty acids and corresponding esters from microalgae oil,fish oil and other sources were summarized,and the application future in separation and purification of fatty acids by high-speed countercurrent chromatography were predicted.

high-speed countercurrent chromatography;fatty acid;detection and analysis;separation and purification

2016-12-29

荣辉(1981-)，男，博士，主要从事微藻油的提取及多不饱和脂肪酸的分离纯化研究，E-mail：ronghui8915@163.com。

*通讯作者:杨贤庆(1963-)，男，本科，研究员，主要从事水产品加工及质量安全方面的研究，E-mail：yxqgd@163.com。

广东省科技计划项目(2014A010107019)；国家重点研发计划项目-生物产业共性技术标准研究项目(2016YFF0202300)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2014TS24)；农业部水产品加工重点实验室开放基金项目(NYJG201407)；广东省农业标准化专项资金项目。

TS201.1

A

1002-0306(2017)13-0319-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.060