石榴种质资源ITS序列分析

徐会丽张太奎苑兆和

石榴种质资源ITS序列分析

徐会丽1，2，张太奎1，2，苑兆和1，2*

(1.南京林业大学/南方现代林业协同创新中心，江苏南京 210037；2.南京林业大学林学院 )

以13个石榴品种的嫩叶为试材提取DNA，进行ITS-PCR扩增。对扩增产物的测序结果构建进化树进行亲缘关系分析。结果表明，13个品种的ITS区段长度在619～704bp之间，转换和颠换比值0.75。系统发育树表明13个石榴品种资源聚为三类，与传统分类学相互支持。ITS序列分析与传统形态分类学相结合的手段为今后石榴的研究、鉴定、分类提供新的思路。

石榴，ITS序列，系统进化树

石榴(PunicagranatumL.)是千屈菜科(Lythraceae)石榴属(PunicaL.)落叶果树[1]，中国栽培历史悠久[2]。石榴以形态美观、营养价值丰富而深受人们的喜爱[3]。目前对石榴品种的鉴定主要还是依据形态学特征和生态分布，但并未形成统一标准。ITS(内部转录间隔区)序列(核糖体RNA基因非转录区的一部分)是介于18S和28S(S为核糖体RNA的沉降系数)之间的非编码转录间隔区[4]，已被证实是研究许多被子植物类群系统与进化的重要的分子标记，能较好地反映植物科内、属间、种间的亲缘关系，近年来被广泛应用于植物的系统演化和亲缘关系的研究。笔者从分子进化和系统发育角度探讨ITS序列与石榴不同栽培品种的亲缘关系，提取13个石榴品种的DNA，采用ITS-PCR扩增产物测序获得其序列，应用Dnasp5.0[5]软件分析ITS序列特征，Clustalx2和MEGA5.0软件构建进化树，从DNA水平探讨石榴栽培品种之间的亲缘关系，为石榴种质的研究、鉴定、分类提供新思路。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

13个石榴品种(表1)：奥斯丁(Austin)、超大籽、

白皮大籽、鲁峪蛋、墨石榴、一串铃、铜皮、净皮甜、俄罗斯(Russia)、厚皮白籽、鲁白榴2号、大粒、秋艳，2013～2015年陆续从山东、陕西、云南等地引进栽植于南京林业大学白马教学基地。2015年3月28日取新鲜石榴叶片液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。

1.2 DNA提取

提取13个石榴品种每个品种的DNA：将采集的叶片放入液氮中快速研磨至粉状，用上海生工生产的磁珠法基因组DNA提取试剂盒(植物)提取样品总DNA。

1.3 ITS序列的PCR扩增及测序

PCR(聚合酶链反应)扩增采用通用引物ITS1和ITS4，上游引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，由上海生工公司合成。2×Taq PCR MasterMix由北京天根生化科技有限公司提供。PCR反应体系为25μL，DNA模板1μL，Taq酶12.5μL，引物ITS1和ITS4各1μL，水9.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性3分钟，55℃退火30秒钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存10分钟。取PCR产物5μL用核酸染色剂4S gree(由上海生工提供)染色，经1%琼脂糖凝胶电泳检

测，用凝胶成像仪拍照。用分光光度计测量DNA浓度。剩余的PCR产物委托上海生工科技有限公司正反测序。

1.4 ITS序列分析

将测序得到的13个石榴品种的ITS序列用ContigExpress软件进行拼接后，用ClustalX2完成DNA序列比对，保存aln格式，运用MEGA5.0软件采用邻接距离矩阵法(Neighbor-joining)构建系统发育树，应用自展法(Bootstrap，1000 replicates) 进行可信度检测，重复1000 次。完全删除序列的Gaps/Missing Data，采用Pairwise deletion法，选用Kimura 2-parameter 模型进行遗传距离计算。运用Dnasp5.0软件进行碱基组成、变异位点数、简约信息位点、转换和颠换数等分析。

2 结果与分析

2.1 提取DNA结果

13份石榴种质叶片DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现所得DNA条带单一无拖带现象，说明提取的DNA质量较高；在DNA多次重复提取过程中，选择提取过程中DNA浓度和纯度都比较高，其中浓度要求在100μg/μL左右。

表1 13个石榴品种的ITS序列长度和碱基G+C含量

2.2 ITS-PCR扩增结果

以提取的DNA为模板，以通用引物ITS1和ITS4进行扩增，结果显示退火温度55℃时扩增效果较好，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示DNA片段长度约700bp。

2.3 ITS序列分析

利用DNAMAN[6]软件对所测13个品种的ITS序列进行组分分析，结果如表1，石榴科供试的13个品种中，只有墨石榴G+C含量达到66.6%，其余12个品种的G+C含量均在65.2%～65.7%之间。13个供试品种的平均G+C含量为65.47%。因此整体含量差异不明显，适于做遗传分析。

2.4 ITS序列变异分析

ITS序列变异分析主要包括转换、颠换、缺失和插入[6]。Dnasp5.0分析表明：13个石榴品种的ITS序列位点中多态性位点(Polymorphics sites)为23，简约信息位点数(Parsimonyinformative sites)为16。核苷酸多样性(Nucleotide diversity)Pi值为0.00025，Theta值为0.00052。ITS1区存在A、G缺失，ITS4区存在T、A、G插入和 A、C、T缺失，转换和颠换比值约为0.75(由表2中转换总数和颠换总数比值可得)。

表2 13个石榴品种的ITS序列变异

2.5 石榴科植物的ITS聚类分析

将13个石榴试验样品与NCBI中同源搜索的4个同源性高的千屈菜科丽薇属的4个品种(其genbank登录号分别为KF494261.1、KF420995.1、JN701292.1、AY905425.1)作为外群，先用ClustalX2.0软件进行序列的完全比对，再用MEGA5.0软件NJ法构建系统进化树[7](图1)，完全删除序列的Gaps/Missing Data，采用Pairwise deletion法，选用Kimura2-parameter 参数模型，所得的遗传距离见表3。

13个石榴品种被分为2支，其中鲁峪蛋、墨石榴、一串铃以100%的支持率被分为一类，其他10个品种被分为一类。其中墨石榴和一串铃仅以50%的支持率聚为一支，说明两者差异度较大。这从形态指标上来说墨石榴是月季石榴的变种，属极矮生种，节密，根部可形成堆塔，果皮及籽粒紫黑色，而一串铃串状结果，果皮粉红，核软可食，两者形态差异较大相一致。

由图1看，奥斯丁(Austin)、超大籽、白皮大籽、铜皮、净皮甜、俄罗斯(Russia)、厚皮白籽、鲁白榴2号、大粒、秋艳10个品种以62%的支持率分为2支，其中厚皮白籽、秋艳、Russia、铜皮、净皮甜聚为一类。其中Russia单独成一支，这是由于Russia品种引种于美国，可能原因是长期环境变化引起的差异。而鲁白榴2号、大粒、白皮大籽、Austin、超大籽5个品种聚为一类。其中白皮大籽、Austin、超大籽都单独形成一支，说明三者亲缘关系较远，由《中国果树志石榴卷》可知白皮大籽以果皮白色较为少见，Austin引种于美国与其他中国品种差异较大，超大籽以籽粒大、果大而著称。因此奥斯丁(Austin)、俄罗斯(Russia)、白皮大籽同其他品种形态指标上的差异也支持了三者亲缘关系较远的论点。

图1 邻接距离矩阵法构建的石榴科植物ITS序列系统发育树

由表3可知，1号Austin与5号墨石榴、6号一串铃、12号大粒三者之间的Kimura 2-parameter距离范围为0.001～0.035，平均遗传距离为0.013。说明Austin与墨石榴、一串铃、大粒三个品种之间亲缘关系较远。而Austin、2号超大籽、3号白皮大籽相互间Kimura 2-parameter距离均为0. 000，说明这3个品种亲缘关系较近。

表3 石榴科植物ITS 序列间的遗传距离

注：横向编号为列数，纵向编号所代表的品种为[1]-Austin，[2]-超大籽，[3]-白皮大籽，[4]-鲁峪蛋，[5]-墨石榴，[6]-一串铃，[7]-铜皮，[8]-净皮甜，[9]-Russia，[10]-厚皮白籽，[11]-鲁白榴2号，[12]-大粒，[13]-秋艳。

3 讨论

由于ITS区具有较丰富的信息位点和变异位点，目前已有文献证实ITS是研究许多被子植物类群系统与进化的重要分子标记。由于ITS能较好地反映出科内、属间、种间的亲缘关系，所以被广泛应用于植物的系统演化及亲缘关系的研究[8-15]。本研究通过Dnasp5.0分析ITS序列特征，表明供试石榴种质材料ITS核苷酸多样性的Pi值和Theta值均很低，说明石榴属ITS不存在假基因现象，符合被子植物ITS 协同进化规律[16,17]。其中净皮甜、铜皮、Russia碱基相似度非常高，可见三者之间的亲缘关系非常近。长期以来，园艺学家对石榴种下分类等级持有不同见解，其亲缘关系和系统进化过程很难确定。本研究对石榴科13个栽培品种进行ITS序列分析，其中墨石榴、一串铃和Austin不仅在形态上差异显著，在亲缘关系上也和其他10个品种差异明显，研究结果支持了形态差异是一定程度进化的结果。形态差异为间接判断亲缘关系提供直观根据。

目前有关石榴科植物的亲缘关系的报道较少。石榴科仅1个属2个种，一种产于印度洋的索克拉克岛上(PunicaprotopunicaBalf)，为野生种，无栽培价值。作为栽培的只有一个种即石榴(PunicagranatumL)。因此，对石榴的分类都在同一个种下进行，从分子方面来讲难免差异度很小。本文利用ITS序列分析尝试从进化方面分析石榴种质间的亲缘关系，为石榴科植物分类提供一种新的方法和思路。未来研究结果还需要选取更多品种来进行验证，以进一步为石榴科植物分类提供理论依据。

[1] 曹尚银，谭洪花，刘丽，等. 中国石榴栽培历史、生产与科研现状及产业化方向. 中国园艺学会石榴分会筹备组. 中国石榴研究进展(一)[C].中国园艺学会石榴分会筹备组，2010:8.

[2] 曹尚银，侯乐峰. 中国果树志:石榴卷[M]. 北京:中国林业出版社，2013:9-17.

[3] 薛辉，曹尚银，牛娟，等. 软籽石榴的生产现状与发展前景[J]. 江苏农业科学，2016，03:24-27.

[4] 刘海龙， 陈晓明， 覃子海， 等. ITS序列在桉树种质资源鉴定中的应用研究 [J]. 西部林业科学， 2010， 39(4):85-88.

[5] Vingron M. Integrating sequence， evolution and functional genomics in regulatory genomics[J]. Genome Biology， 2009， 10(1):1-8.

[6] 徐丽，陈新，魏海蓉，等. 核桃种质资源rDNA-ITS序列分析[J]. 山东农业科学， 2016，03:1-4.

[7] 洪明伟，杨荣萍，李文祥，等.石榴ISSR-PCR反应体系的优化研究[J].云南农业大学学报，2008，23(1):15-18.

[8] 刘峥，张汉尧. 旋花科植物ITS序列分析[J]. 西部林业科学，2012，(4):70-74.

[9] 何文，张静，黄智林，等. 基于ITS序列对栽培中国樱桃遗传多样性及其群体遗传结构的分析[J]. 西北植物学报，2014，03:463-472.

[10] Somayeh S， Shahin Z， Rabeler R K， et al. Molecular phylogenetic analysis of Arenaria (Caryophyllaceae: tribe Arenarieae) and its allies inferred from nuclear DNA internal transcribed spacer and plastid DNA rps16 sequences[J]. Botanical Journal of the Linnean Society，2015，178(4):648-669.

[11] 黄智林. ITS序列在三个樱桃栽培种中的遗传多样性分析和应用评价[D]. 四川农业大学，2015.

[12] 姜生秀，兰海燕，廖明康. 利用rDNA ITS序列对新疆桃和普通桃亲缘关系的分析[J]. 新疆大学学报(自然科学版)，2013，01:95-99.

[13] 张丽，王小蓉，王燕，等. DNA序列在悬钩子属植物分子系统学研究中的应用进展[J]. 西北植物学报， 2014，02:423-430.

[14] 张蕾，邱道寿，蔡时可，等. 铁皮石斛及其混伪品的rDNA ITS序列分析与鉴别[J]. 安徽农业科学， 2013(7):2872-2874.

[15] 何文. 基于ITS序列的栽培中国樱桃遗传多样性及其群体遗传结构分析[D]. 四川农业大学， 2014.

[16] Chen J R，Shiau Y J. Application of internal transcribed spacers and maturase K markers for identifying Anoectochilus， Ludisia， and Ludochilus[J]. Biologia Plantarum，2015，59(3):485-490.

[17] Ghada B，Ahmed B A，Messaoud M，et al. Genetic diversity and molecular evolution of the internal transcribed spacer (ITSs) of nuclear ribosomal DNA in the Tunisian fig cultivars ( Ficus carica，L.; Moracea)[J]. Biochemical Systematics & Ecology，2013，48(12):20-33.

2016-10-24

国家自然科学基金项目(31272143)；南京林业大学高层次人才科研启动基金(GXL2014070)；江苏省高校优势学科建设工程项目(PAPD)。

徐会丽(1993-)，女，江苏盐城人，研究生，主要研究构建石榴组织培养体系。E-mail: xuhuili_xul5986@126.com

S665.4

A

1002-2910(2017)02-0004-04

*通讯作者：苑兆和(1963-)，男，山东招远人，教授，博士生导师，研究方向为经济林培育与分子生物学。