小半夏加茯苓汤醇提物对BGC-823细胞线粒体凋亡通路的影响

闫文娟 贾亚玲 陈丽丽 何前松 冯 泳*

1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002；2.贵州省铜仁市万山区人民医院中医科,贵州 铜仁 554200

小半夏加茯苓汤醇提物对BGC-823细胞线粒体凋亡通路的影响

闫文娟1贾亚玲2陈丽丽1何前松1冯 泳1*

1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002；2.贵州省铜仁市万山区人民医院中医科,贵州 铜仁 554200

目的: 观察小半夏加茯苓汤醇提物对胃癌细胞BGC-823的凋亡作用以及诱导其凋亡发生的机制。方法:运用MTT法检测不同浓度的小半夏加茯苓汤醇提物对BGC-823的增殖抑制作用并计算抑制率；以罗丹明123为细胞染色剂，采用流式细胞术检测线粒体跨膜电位的改变；实时荧光定量PCR检测Bax、Bcl-2和Cyt-c表达的变化。结果:MTT结果显示小半夏加茯苓汤醇提物对BGC-823具有抑制作用，随着给药浓度的增加和作用时间的延长，抑制率逐渐升高，细胞活力逐渐减弱，与空白对照组比较有显著统计学差异(P<0.01)。流式细胞术结果显示,与空白对照组相比，小半夏加茯苓汤醇提物能够显著降低线粒体跨膜电位(P<0.01)；qRT-PCR结果显示，Bax基因表达显著升高(P<0.01),Cyt-c基因表达升高(P<0.05)，Bcl-2基因的表达降低(P<0.05)。结论:小半夏加茯苓汤醇提物可以抑制BGC-823细胞活力，诱导细胞凋亡并减小Bcl-2/Bax基因表达比例，增强Cyt-c基因表达，其机制可能与线粒体为核心的凋亡通路相关。

小半夏加茯苓汤；胃癌细胞BGC-823；凋亡；线粒体；

胃癌作为常见的消化道系统肿瘤之一，其发病率和死亡率在中国排名第三[1]。胃癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗，但放化疗引起的恶心、呕吐、食欲不振等消化道反应，如果未得到有效的控制，将降低胃癌患者的依从性及生存质量而放弃治疗。小半夏加茯苓汤(Xiao Banxia plus Fuling Decoction，XBFD)源于《金匮要略》，全方由半夏、生姜、茯苓组成，现代研究证实半夏、生姜、茯苓三味药均有不同程度的抗肿瘤作用[3-5]。具有散饮降逆、和胃止呕的作用，临床上对于化疗所致的迟发性呕吐症状有明显疗效，较甲氧氯普安疗效更好[2]。在辨证论治痰证肿瘤时亦常用到半夏、生姜、茯苓三味药，为了进一步明确小半夏加茯苓汤复方抗肿瘤的作用机理，本实验以胃癌细胞BGC-823为对象，运用流式细胞术、实时荧光定量PCR(Real Time PCR，RT-qPCR)等方法，检测线粒体跨膜电位(mitochondrialmembrane potential，MMP)以及相关基因表达的变化。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂 人胃癌细胞BGC-823系购自上海细胞库。小半夏加茯苓汤醇提物(取生半夏18g，茯苓9g，生姜15g，50%乙醇于85℃水浴锅中提取，摇匀，干燥后称取1.5g小半夏加茯苓汤醇提物干粉，用50mL 50%乙醇溶解，得30mg/mL母液，稀释后使用[6])、高糖DMEM培养基、胰蛋白酶、双抗、磷酸盐缓冲液均购自美国Hyclone公司、胎牛血清购自美国Gibco公司、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、罗丹明123(Rhodamine 123，Rh123)均购自美国Sigma公司、Annexin V FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司、RNA提取试剂盒购自天根生化公司、Thermo ScientificMaxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 购自 Thermo Scientific公司、引物由上海生工公司合成。

1.2 主要仪器 二氧化碳培养箱(Thermofisher，USA)、低温高速离心机(Beckman Coulter，USA)、多功能酶标仪(BioTek Synergy H4，USA)、流式细胞仪(BD，USA)、NanoDrop2000(Thermofisher，USA)、实时荧光定量PCR仪(ABI ViiA7TMDx Fast，USA)。

2 方法

2.1 细胞培养和分组 BGC-823细胞接种于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱内常规培养。将细胞分为小半夏加茯苓汤醇提物组(800μg/mL、700μg/mL、600μg/mL、500μg/mL、400μg/mL)，同时设不加药物的完全培养液为空白对照组和乙醇溶剂对照组。分别检测12、24h的实验结果。

2.2 MTT 法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期的胃癌细胞BGC-823以6×104/孔接种于96孔板，预先设定调零组、空白对照组、乙醇溶剂对照组和给药组，给药组分别加入不同浓度的XBFD醇提物，乙醇溶剂对照组加入与800μg/mL实验组等量的50%乙醇，每个组至少设三个平行孔。分别培养12h、24h后，每孔加入200μl 含浓度为5mg/mL MTT的培养液，37℃孵育4h后，弃液后加入DMSO 150μl，振荡器充分振荡后以490nm波长测定各孔吸光度(OD)，并记录结果计算抑制率。抑制率=[1-(给药组OD值-调零组OD值)/(空白组OD值-调零组OD值)]×100%。

2.3 流式细胞术检测(Flow Cytometry，FCM)MMP的改变 取对数生长期的BGC-823细胞接种于6孔板中,待细胞贴壁后,设实验组为终浓度600μg/mL的XBFD醇提物溶液，空白对照组加入与实验组等量的50%乙醇，相同的条件下分别培养12h，24h。收集上清，用预冷的PBS洗涤细胞3遍，收集洗涤液，按AnnexinⅤ/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，并加入5μlRh123染色，常温避光孵育10-30min后，上流式细胞仪检测，每个样本检测10000个细胞，测定相对荧光强度，以荧光强度的变化表示线粒体膜电位的变化。

2.4 qRT-PCR法检测bax、Bcl-2和细胞色素C(Cytochrome C，Cyt-c) mRNA的相对表达量 收集并提取经600μg/mL的XBFD醇提物处理24h后的BGC-823细胞总RNA，紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，并以此cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL：2μL cDNA模板，2×SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 10μL，水9μL，上下游引物各0.75μL。引物设计详见表1。实验操作按产品说明书进行,PCR反应条件为：50℃2min，95℃10min，(95℃ 15sec，60℃ 30sec,92℃ 30sec)×40个循环。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，根据qRT-PCR检测结果，分析得出各个样品量的循环阈值(Ct)，以β-actin作为内参照，实验设有 3 次重复，采用2-△△CT法计算mRNA的相对定量分析。

表1 Real-timePCR 引物序列

3 结果

3.1 不同浓度XBFD醇提物对胃癌细胞增殖的影响 不同浓度的XBFD醇提物作用于胃癌细胞系BGC-823后，胃癌细胞增殖抑制率见表2，图1。图1显示XBFD醇提物对BGC-823细胞活力的影响呈现“浓度-时间依赖性”的关系，即随着给药浓度的增加和作用时间的延长，对细胞的增殖抑制率逐渐升高，细胞活力逐渐减弱，具有统计学差异(P<0.01)。

表2 不同浓度的XBFD醇提物对BGC-823的抑制作用

注：组间比较，*P<0.01；不同时段相比，#P<0.01

3.2 XBFD醇提物对BGC-823 MMP的影响 XBFD醇提物作用BGC-82312h、24h后，实验组荧光强度显著高于空白对照组(见表3，图2)，提示MMP明显降低，实验组与空白对照组差异具有统计学意义(P<0.01)。

3.3 XBFD醇提物对BGC-823凋亡相关基因bax、Bcl-2和Cyt-c基因的影响 采用qRT-PCR方法，检测600μg/mL的小半夏加茯苓醇提物干预BGC-823 24h后，细胞内Bax、Bcl-2和Cyt-c基因相对表达量的变化。Bax基因检测结果表明与空白对照组相比，实验组中Bax基因相对表达量变化明显升高(P<0.01)，Cyt-c基因相对表达量变化升高(P<0.05)；Bcl-2相对表达量变化降低(P<0.05)(见表4)。

表3 XBFD醇提物对BGC-823荧光强度的影响

注：与同时段空白对照组相比，*P<0.01。

表4 XBFD醇提物对BGC-823凋亡基因表达的影响

注：同一基因与空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01。

4 讨论

中医学认为胃癌属于“胃反”、“噎嗝”、“胃脘痛”、“积聚”、“伏梁”等症的范畴，其病机与脾胃虚弱、痰浊阻滞有关[7]。痰饮与肿瘤关系密切[8]，诸多医家提倡肿瘤当“从痰饮论治”[9]，“当以温药和之”[10]。痰饮的治疗大法首载于《金匮要略》，并用小半夏加茯苓汤作为治疗痰饮的名方。小半夏加茯苓汤用于临床的止呕研究较多，但对抗肿瘤作用机理的研究较少。本课题组前期研究表明，该复方对于肿瘤细胞有促凋亡和提高机体免疫力的作用。杨长福等[11]发现小半夏加茯苓汤可抑制HepG2细胞增殖及促进凋亡，机制可能通过激活caspase-3蛋白表达，阻滞细胞周期于S期，从而诱导肝癌细胞凋亡。何前松等[12]发现小半夏加茯苓颗粒含药血清可下调SGC-7901细胞Bcl-2基因表达,抑制细胞生长增殖,其作用机制可能与诱导细胞凋亡或细胞毒作用有关。蔡琨等[13]发现小半夏加茯苓颗粒可增强荷瘤小鼠的免疫功能，抑制模型鼠肿瘤的生长，具有一定的肿瘤抑制及免疫调节作用。本实验以BGC-823为研究对象，采用小半夏加茯苓汤醇提物用于体外实验，实验结果显示，小半夏加茯苓汤醇提物对BGC-823细胞具有增殖抑制作用，并且呈现出明显的量效时效关系。

细胞凋亡信号转导通路主要包括内源途径(又称线粒体凋亡途径)、外源途径(又称死亡受体凋亡途径)以及非依赖caspase凋亡途径[14]。在细胞接受凋亡信号后，线粒体膜电位降低可以使线粒体内释放一系列凋亡因子可引起如Cyt-c和Apaf-1等到细胞质中, 激活下游的caspase家族, 促使细胞凋亡的发生[15]。本实验选择罗丹明123染色后流式细胞术检测线粒体跨膜电位。Rh123是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，导致荧光强度减弱或消失，而在细胞发生凋亡时，线粒体膜完整性被破坏，引起线粒体跨膜电位的崩溃，Rh123重新释放出线粒体，从而发出强黄绿色荧光[16]。FCM结果显示，给药组细胞荧光强度增强，提示XBFD醇提物能够降低线粒体跨膜电位，说明XBFD醇提物诱导肿瘤细胞发生凋亡其中途径之一可能与损伤肿瘤细胞的线粒体相关。

Bcl-2家族是线粒体凋亡途径的重要因子，与肿瘤的发生息息相关[17]。正常情况下Bax是以单体形式存在于线粒体膜上，当细胞接受凋亡信号时，Bax能自身形成同源二聚体(Bax/Bax)促进Cyt-c的释放，促进细胞凋亡[18]。Bcl-2位于线粒体外膜，Bcl-2可以与Bax形成异源二聚体(Bcl-2/Bax)以抑制细胞凋亡。因此Bcl-2/Bax比例是决定细胞凋亡与否的关键因素。当Bcl-2/Bax值降低时，细胞凋亡趋势增加[19]。本实验中促凋亡基因Bax在小半夏加茯苓汤诱导的胃癌细胞BGC-823中的表达上调，Bcl-2的表达下调，Bcl-2/Bax比例减小，使线粒体膜电位降低，通透性增强，细胞凋亡相关因子和Cyt-c被大量释放到胞质中，导致BGC-823细胞启动线粒体途径发生凋亡。

因此，小半夏加茯苓汤对人胃癌BGC-823细胞有生长抑制和诱导凋亡作用,其诱导凋亡机制可能与线粒体损伤同时伴随下调Bcl-2/Bax比例，促进Cyt-c大量释放有关。但细胞凋亡是一个复杂的过程，具体机制还需进一步研究。

[1]Lu Y, Zhang X, Zhang H, et al.Citrate induces apoptotic cell death: a promising way for treating gastric carcinoma[J].Anti-cancer Res, 2011, 31(3):797-805．

[2]陈娟,方明治,杨兴华.小半夏加茯苓汤治疗化疗致迟发性呕吐的临床疗效观察[J].天津中医药,2013,03:148-150.

[3]黄海霞,张明星,张萌，等.掌叶半夏提取物对宫颈癌荷瘤小鼠脾脏免疫的作用[J].复旦学报(医学版),2016,05:534-542.

[4]孟运莲,蔡丽华,吴慧芬.化学修饰的茯苓多糖抗肿瘤效应的免疫组织化学观察[J].武汉大学学报,2007,28(1):67-69．

[5]曾慧兰,韩新爱,古晨，等.6-姜酚诱导白血病细胞凋亡中细胞内活性氧及线粒体跨膜电位的改变[J].中药材,2010,04:584-587.

[6]叶俊,杨占南,何前松，等.HPLC法测定中药复方小半夏加茯苓汤中的8种药效成分[J].辽宁中医杂志,2012,3(8):1595-1598.

[7]张晓春,彭海燕,邓旭坤，等.半夏泻心汤在肿瘤治疗中的应用[J].中华中医药,2005,05:298-300.

[8]陈新莲,林胜友.中医学对癥瘕积聚认识及意义[J].江西中医药,2009,11:5-6.

[9]魏品康,孙大志.胃癌痰发病学说的探讨[J].医学与哲学(临床决策论坛版),2008,10:47-49.

[10]王景良,汤继军.从“阳虚阴结”论治恶性肿瘤[J].中医杂志,2016,10:887-889.

[11]杨长福,冯泳,何前松.小半夏加茯苓方含药血清抑制HepG2细胞增殖及促进凋亡[J].中国实验方剂学,2011,08:168-171.

[12]何前松,孟庆华,冯泳，等.小半夏加茯苓颗粒对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响[J].陕西中医学院学报,2010,06:67-69.

[13]蔡琨,冯泳,何前松，等.小半夏加茯苓汤对H22荷瘤小鼠的抑瘤及免疫调节作用[J].实用医学杂志,2011,07:1290-1292.

[14] Portt L,Norman G,Clapp C,et al.Anti-apoptosis and cell survival:a review.Biochim Biophys Acta,2011,1813:238-259．

[15]MavridouDA, FergusonSJ, StevensJM.Cytochrome Cassembly [J].IUBMBFife, 2013,65(3):209-216．

[16]丁玉梅,翁梦婷,毛云子，等.鳄胆素与阿霉素联合应用对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响[J].厦门大学学报(自然科学版),2016,01:72-77.

[17]Lincet H, Kafara P, Giffard F, et al.Inhibition of Mcl-1 expression by citrate enhances the effect of Bcl-xl inhibitors on humanovarian carcinoma cells[J]．JOvarian Res，2013,6(1):72.

[18]Qu M, Zhou Z, Chen C, et al.Inhibition of mitochondrial permeability transition pore openingis involved in the protective effects of mortalin overexpression against beta-amy-loid induced apoptosis in SHSY5Y cells[J]．NeurosciRes, 2012, 72(1):94-102．

[19]Lindsay J, Esposti MD, Gilmore AP.Bcl-2 proteins and mitochondria-Specificity in membrane targeting for death[J].Biochim Biophys Acta, 2011, 1813(4): 532-539．

The Effects of the Xiaobanxia Plus Fuling Ethanol Extract on Mitochondrial ApoptoticPathway in BGC-823 Cells

YAN Wenjuan1JIA Yaling2CHEN Lili1HE Qiansong3FENG Yong1*

1.GuiYang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang Guizhou 550002, China；2.Department of Traditional Chinese Medicine Wanshan District People's Hospital, Tongren Guizhou 554200, China

Objective To observe the effect of Xiao Banxia Plus Fuling Ethanol Extract on gastric cancer cell BGC-823 apoptosis and its mechanism induced apoptosis.Methods MTT was used to detect different concentrations of Xiao Banxia Plus Fuling Ethanol Extract on proliferation of BGC-823 inhibition and calculate the inhibition rate ; Rhodamine 123 cell stain, Flow Cytometry was used to detect changes of mitochondrial membrane potential; Real-time PCR to detect Bax, Bcl-2 and Cyt-c the change of expression.Results MTT results showed that Xiao Banxia Plus Fuling Ethanol Extract has an inhibitory effect on BGC-823, with the increase of drug concentration and action time, the inhibition rate increased gradually,the cell viability decreased, there wassignificant differencecompared with the control group (P<0.01).Flow Cytometryresults showed that, compared with the control group, Xiao Banxia Plus Fuling Ethanol Extract cansignificantlyreduce the mitochondrial membrane potential(P<0.01); qRT-PCR results showed that baxgeneexpressionincreased significantly,Cyt-c gene expressionincreased, the Bcl-2 gene decreased (P<0.05).Conclusion Xiao Banxia Plus Fuling Ethanol Extract could reduce the BGC-823 cells viability, induce apoptosis and down-regulate the proportion of gene expression of Bcl-2, Bax in BGC-823 cells, Enhance Cyt-c gene expression.The mechanism may be related to the mitochondrial apoptotic pathway.

Xiaobanxia Plus Fuling Ethanol Extract; Gastric Cancer Cell BGC-823; Apoptosis; Mitochondria

国家自然科学基金(No.81160425/H2705)。

闫文娟(1989-)，女，汉族，硕士研究生在读，研究方向为中药复方配伍。E-mail:303497591@qq.com

冯泳(1964-)，女，汉族，教授，研究方向为中药复方配伍研究。E-mail:fy668@sina.com

R285.5

A

1007-8517(2017)05-0042-04

2016-12-23 编辑：程鹏飞)