瑶药岗松抗佐剂性大鼠关节炎的实验研究

赵会勤 李超杰 徐玉洁 贾 奥 贾贝西* 贾成军

1.郑州大学药学院，河南 郑州 450001；2.河南省中医院，河南 郑州 450002

实验研究

瑶药岗松抗佐剂性大鼠关节炎的实验研究

赵会勤1李超杰1徐玉洁1贾 奥1贾贝西1*贾成军2

1.郑州大学药学院，河南 郑州 450001；2.河南省中医院，河南 郑州 450002

目的：观察瑶药岗松根醇提物(BFTE)对大鼠佐剂性关节炎(AA)的药理作用。方法：42只大鼠随机分为正常组、模型组、雷公藤多苷组及BFTE高、中、低剂量组，完全弗氏佐剂诱导AA后，于第12天开始连续灌胃给药16d；同一时间点测定大鼠足趾肿胀度、关节炎评分、免疫器官指数；第29天处死大鼠，酶联免疫法(ELISA)测定大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量，光学显微镜观察大鼠踝关节的病理变化。结果：与模型组相比，BFTE能够显著抑制AA大鼠的原发性和继发性足跖肿胀度，降低关节炎评分、免疫器官系数，改善大鼠踝关节病理状态，下调AA大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。结论：BFTE对AA大鼠具有良好的治疗作用，其抗炎免疫的机理可能与减少TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌有关。

瑶药；岗松；类风湿关节炎；佐剂性关节炎；炎症因子

桃金娘科植物岗松(BaeckeafrutescensL.)为广西瑶族民间习用药材，盘瑶语称“朴老中”，产于我国的南部地区，全株均可入药，具有化瘀止痛、清热解毒、利尿通淋、杀虫止痒的功效，临床用于感冒高热、黄疸型肝炎、胃痛、肠炎、风湿关节痛、脚气病、膀胱炎、小便不利等[1-2]。目前，岗松资源的开发利用仅以地上部分(枝叶)所含挥发油为主，而对地下部分(根)的研究报道较少。课题组对岗松根进行了较为系统的化学研究，分离鉴定Baeckeins A-I共9个新化合物[3-6]，并进行初步的抗炎活性评价。本研究在前期基础上，结合民间用药习惯及文献资料记载，拟对岗松根醇提物抗类风湿关节炎(RA)的药理作用开展研究，并在细胞水平探讨其可能的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 SD大鼠，雄性，体重180～220 g，购自购自河南省实验动物中心，动物合格证号：SYXK(豫)2011-0001。

1.2 药品与试剂 瑶药岗松采自广西南宁，经广西民族医药研究院戴彬主任医师鉴定为BaeckeafrutescensL.的根，经95%乙醇提取、回收溶剂得总浸膏(BFTE)，使用时用0.5% CMC-Na溶液的配制成所需浓度。雷公藤多苷片(上海复旦复华药业有限公司)；完全弗氏佐剂(CFA，美国Sigma公司)；TNF-α ELISA试剂盒、IL-6 ELISA 试剂盒和IL-1β ELISA 试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司)；甲醛(天津市风船试剂科技有限公司)。

1.3 仪器 电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；外径千分尺(Radio Shack Corporation)；离心机(上海安亭科学仪器厂)；全自动酶标仪(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司)。

2 方法

2.1 AA大鼠模型的制备及分组给药 从4 ℃冰箱中取出CFA，充分振荡、混匀；将大鼠右后肢拉直，用75%的酒精消毒，使用l mL注射器于大鼠足跖皮内注射0.15 mL CFA致炎，正常对照组大鼠注射等体积的生理盐水[7-9]。将42只大鼠随机分为正常组、模型组、雷公藤多苷组、岗松根醇提物高(BFTE-H)、中(BFTE-M)、低(BFTE-L)剂量组，每组7只；于造模后第12天开始灌胃给药，连续给药16 d；雷公藤多苷组给予雷公藤多苷10 mg/kg，BFTE-H、BFTE-M、BFTE-L组分别给予BFTE 6.0、3.0、1.5 g生药/kg/d，正常组及模型组给予等量的0.5% CMC-Na溶液。

2.2 足趾肿胀度 于造模前及造模后12、24、36、48h用电子游标卡尺测量大鼠右后足跖厚度，以致炎前后的差值作为大鼠的足趾肿胀度(即足趾肿胀度=致炎后足趾厚度-致炎前足趾厚度)[10-11]，以后每4 d测量一次(即4、8、12、16、20、24、28d)，观察AA大鼠原发性和继发性足跖肿胀。

2.3 关节炎指数 大鼠炎症出现后，每隔4d观察并记录病变程度。病变程度按5级评分法评价：0分-无红肿，1分-关节有红色斑点或轻度肿胀，2分-关节中度红肿，3分-关节重度红肿，4分-关节严重肿胀并伴有功能障碍；累计大鼠各个关节的评分和即为关节炎指数，每只大鼠最多评16分[12]。

2.4 细胞因子 大鼠继续给药至28d，禁食但不禁水12 h，于第29天称量各组大鼠的体重，用20%乌拉坦(20g/100 mL)腹腔注射麻醉(0.6mL/100g)，腹主动脉取血，凝血后离心分离血清，按照试剂盒说明，采用ELISA法分别测定TNF-α、IL-6、IL-1β的含量[13]。

2.5 免疫器官系数 于第29d大鼠取血后，摘除胸腺和脾，用生理盐水冲洗后，用滤纸吸除多余的水分，电子天平称重，计算胸腺和脾脏指数(脏器指数=脏器重量(mg)/体重(g))[14]。

2.6 病理切片 第29天处死各组大鼠，取下包括踝关节在内的整个右足爪，置于4%多聚甲醛中固定48 h后，使用10%EDTA脱钙完全后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，苏木精-伊红(HE)[15]，在高倍显微镜下观察大鼠踝关节的病理变化。

3 结果与讨论

3.1 BFTE对AA大鼠原发性足趾肿胀的影响 与正常组相比，各组大鼠右侧足跖肿胀明显(P< 0.01)，除正常组以外的其它各组间大鼠足跖肿胀无统计学差异，显示造模成功(见表1)。于造模第12天开始灌胃给药，雷公藤多苷组、BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L组在给药12d和16d(即造模24d和28d)后能有效减轻大鼠原发足跖肿胀程度；造模28d时，与模型组相比，雷公藤多苷组、BFTE-H和BFTE-L组有统计学差异(P<0.05)，BFTE-M组有显著统计学差异(P<0.01)；与雷公藤多苷组相比，BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L组无统计学差异(P>0.05)，而BFTE各剂量组间也无统计学差异(P>0.05)(表2)。由此可见，BFTE能够显著降低AA大鼠原发性足趾肿胀，BFTE-M组效果最好。

表1给药前AA大鼠的原发性足跖肿胀度 ±s，n=7)

注：与正常组比较，##P<0.01。

表2 给药后AA大鼠的原发性足跖肿胀度 ±s，n=7)

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 BFTE对AA大鼠继发性足趾肿胀的影响 除正常组外的各组大鼠，于造模后第12天出现继发性左后足跖肿胀，第16天达到高峰。与正常组相比，第12天开始各组大鼠均出现明显的足跖肿胀(P<0.05)；给药12d(即造模24d)后，雷公藤多苷组和BFTE各剂量组能够显著降低AA大鼠继发性足趾肿胀程度(P<0.05)；给药16d(即造模28d)后，各给药组大鼠继发性足趾肿胀程度继续降低，与模型组相比，均具有极显著统计学差异(P<0.01)；与雷公藤多苷组相比，BFTE各剂量组无统计学差异(P>0.05)，而BFTE各组间也无统计学差异(P>0.05)。表明BFTE对AA大鼠继发性足趾肿胀具有显著的抑制作用，且BFTE-M组作用最强。见表3。

表3 AA大鼠的继发性足跖肿胀度

注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 BFTE对AA大鼠关节炎指数的影响 模型组大鼠于造模12h后原发侧足跖急速肿胀，关节炎指数升至3左右；8d后肿胀向膝关节蔓延，关节炎指数升至4左右；12d继发侧足跖开始出现肿胀，且大鼠前趾也开始出现红肿，关节炎指数有大幅度提升；随病程延长，关节炎指数持续升高，24d达到高峰。20d时各给药组大鼠的原发侧和继发侧足跖肿胀开始降低，前爪足趾红肿也有所减轻；28d时，与模型组相比，雷公藤多苷组、BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L组具有极显著统计学差异(P<0.01)，而与雷公藤多苷组相比，BFTE各剂量组无统计学差异(P>0.05)，表明BFTE能显著改善AA大鼠的关节炎症状。见表4。

表4 各组大鼠的关节炎评分情况 ±s，n=7)

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 BFTE对AA大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影响 与正常组相比，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著增高(P<0.01)；与模型组相比，BFTE各剂量组对AA大鼠血清中的IL-1β和IL-6均具有极显著的抑制作用(P<0.01)，BFTE-M和BFTE-L组对TNF-α也具有显著作用(P<0.05)；与雷公藤多苷组相比，BFTE-H和BFTE-M组对大鼠血清中IL-1β的抑制作用显著(P<0.05)(见表5)。由此可见，BFTE在降低AA大鼠血清中的IL-1β方面更为突出，其作用优于阳性药雷公藤多苷，且量效关系明显。

表5 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量

注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与雷公藤多苷组相比较，%P<0.05，%%P<0.01。

3.5 BFTE对AA大鼠免疫器官系数的影响 与正常组相比，模型组大鼠的脾系数和胸腺系数均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，BFTE-M和BFTE-L组的脾系数和胸腺系数有统计学差异(P<0.05)，而BFTE-H组无统计学差异(P>0.05)；与雷公藤多苷组相比，BFTE各剂量组均无统计学差异(P>0.05)。表明BFTE对AA大鼠免疫器官具有保护作用，但BFTE-L组效果较好。见表6。

表6 各组大鼠的免疫器官指数

注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.6 BFTE对AA大鼠踝关节病理变化的影响 大鼠踝关节病理检查显示：正常组大鼠滑膜上皮规整、单层排列，软骨光滑清晰，关节腔内清晰、无炎性细胞浸润；模型组大鼠滑膜有组织增生和炎性细胞的滋润，且软骨有一定的剥落；给予雷公藤多苷或不同剂量的BFTE治疗后，大鼠的滑膜组织增生、软骨破坏及炎性细胞浸润均有不同程度的减轻。见图1。

4 讨论

佐剂性关节炎大鼠是一种免疫性炎症模型，是筛选和评价抗风湿药常用的模型之一，其发病机制和病理表现与人类类风湿性关节炎类似；该模型造模简单易行、周期短、重复性好，被认为是研究类风湿性关节炎最为理想的模型之一。研究表明，炎性细胞因子在RA发病过程中起重要作用，尤其是参与炎症的全过程，加重炎性反应；TNF-α与IL-1β是促炎性细胞因子，常同时合成分泌，被称为姊妹细胞因子；TNF-α刺激IL-6和IL-1β的释放，致使炎症反应加重，并且能促进滑膜及内皮细胞成纤维细胞因子的产生，破坏滑膜细胞和软骨细胞，引起滑膜增生、软骨的破坏；IL-1β诱导TNF-α和IL-6的表达，促进滑膜细胞、软骨细胞的增值，致使关节损坏；IL-6不仅增强 IL-1β和TNF-α的效应，还能促进类风湿因子的合成。

本研究基于AA大鼠模型，对瑶药岗松根的醇提物进行抗风湿活性评价，结果表明，岗松根能够显著减轻AA大鼠的原发性和继发性足趾肿胀度，降低关节炎指数、保护免疫器官，改善大鼠踝关节的病理状态，下调AA大鼠血清中炎症因子水平，显示出良好的抗炎免疫作用，并呈现出一定的量效关系，其作用机制可能调节机体免疫功能、减少IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌；本研究通过整体动物实验验证了岗松根的抗风湿效用，该研究可为瑶药岗松的资源开发和临床应用提供科学依据。

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Experimental Study on Anti-adjuvant Arthritis in Rats of Baeckeafrutescens

ZHAO Huiqin1LI Chaojie1XU Yujie1JIA Ao1JIA Beixi1*JIA Chengjun2

1.College of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China；2.Henan Province Hospital of TCM, Zhengzhou 450002, China

Objective To investigatethe pharmacological effects of Baeckea frutescens on adjuvant arthritis (AA) rats.Methods The 42 rats were randomly divided into six groups, including normal group, model group, positive control group (tripterygium glycosides), and high/medium/low dose groups oftotal extract of B.frutescens (BFTE).The complete Freund's adjuvant (CFA)-induced AA rats were used as model.After modeling, the intragastric administration began on the 12th day and last for 16 days, and the articular swelling, arthritis score, and immune organ index were measured during this time.The rats were sacrificed on the 29th day, and the inflammatory factors of TNF-α, IL-6, and IL-1β in the serum were detected by ELISA, and the pathological sections for ankle joints were made by hematoxylin-eosin (HE) staining.Results Compared with the model group, the BFTE could significantly inhibit the primary and secondary articular swelling, lower the arthritis score and immune organ index, improve the ankle pathologies, and reduce the serum levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β.Conclusion The roots of B.frutescens showed significant therapeutic effect on AA rats, and the anti-inflammatory immunemechanism may be related to decreasing the secretion of TNF-α, IL-6, and IL-1β.

Yao Medicine; Baeckea Frutescens; Rheumatoid Arthritis; Adjuvant Arthritis; Inflammatory Cytokines

国家自然科学基金(NO.：81303162)；中国博士后科学基金(NO.：2015T80784、2014M552017)；河南省博士后科研资助(NO.：2013010)。

赵会勤(1990-)，女，汉族，硕士研究生在读，研究方向为中药活性成分及质量评价。E-mail:1320581532@qq.com

贾贝西(1982-)，女，汉族，博士，讲师，研究方向为中药活性成分及质量评价。E-mail：jiabeixi_2003_123@163.com

R282.7

A

1007-8517(2017)05-0037-05

2017-01-03 编辑：程鹏飞)