岗梅枝枯病病原鉴定

何凌冰，吴惠萍，游春平，陈炳旭，韩正洲，徐 冰，兰金旭，邢建永

（1.深圳国家高技术产业创新中心，广东 深圳 518000；

2.仲恺农业工程学院农学院，广东 广州 510225；

3. 广东省农科院植物保护研究所，广东 广州 510640；

4. 华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518000）

岗梅枝枯病病原鉴定

何凌冰1，吴惠萍2，游春平2，陈炳旭3，韩正洲4，徐 冰4，兰金旭4，邢建永4

（1.深圳国家高技术产业创新中心，广东 深圳 518000；

2.仲恺农业工程学院农学院，广东 广州 510225；

3. 广东省农科院植物保护研究所，广东 广州 510640；

4. 华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518000）

岗梅是一种具有重要药用价值的植物，在我国主要分布于广西、广东、福建、江西、湖南和台湾等地。岗梅枝枯病是岗梅生产上的重要病害。根据Koch’s法则，对岗梅枝枯病病原分离物进行致病性测定，并利用真菌通用引物ITS1和ITS4对该病原菌的rDNA间隔转录区（ITS）进行扩增和序列分析，结果显示，在GenBank上，与该病菌ITS序列相似度在99%以上的均是葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。因此，初步将岗梅枝枯病病原鉴定为葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。

岗梅枝枯病；致病性测定；病原鉴定；间隔转录区

岗梅（Ilex asprella），别名星树、土甘草、天星木、百解茶，属于双子叶植物纲无患子目冬青科冬青属的梅叶冬青［1］。主要分布于广东、广西、海南、江西、湖南、福建、浙江、安徽、湖北、江苏、台湾等地。岗梅在临床应用非常广泛，是华南地区较常用的一种中药材，具有清热解毒、生津、利咽和散瘀止痛之功效，通常应用于感冒发热、扁桃体炎、气管炎、咽喉炎和肠炎等［2］；其叶片对心绞痛、冠心病等有一定疗效［3］。由于岗梅独特的药用价值，其需求量也越来越大。随着岗梅大面积栽培与发展，一些病虫害也相继发生，其中岗梅枝（茎）枯病尤其严重，发病率为5%～30%，为害重的整株枯死率可达10%，严重影响岗梅的生产发展。目前关于岗梅枝枯病病原的报道，袁勤峰等［4］认为是胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides complex），但是否还有其他病原菌并不清楚。为此，我们对岗梅枝枯病的病原进行鉴定，研究结果对病害防治具有重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物岗梅（Ilex asprella）苗，株高约40 cm，由华润三九医药股份有限公司提供。

罹病岗梅采自梅州市平远县。

培养基PDA配方参照《植病研究法》［5］。

1.2 岗梅枝枯病病原菌的分离、纯化和致病性测定

测定方法参照方中达《植病研究法》并作适当修改，病原菌纯化采用单菌丝片段分离法。分离物的接种方法：将分离和纯化的菌丝块（1 cm×1 cm）接种（针刺法）于无病健康且长势相近的6株岗梅幼苗茎部，用湿润的棉花覆盖固定好，接种无菌PDA培养基（1 cm×1 cm）作为对照，保湿培养5～10 d后，观察分离物的致病情况。

对接种发病的岗梅病组织进行病原菌分离纯化，比较该分离物与原接种物的形态和分子特征，最后将该分离物再次进行致病性测定。

1.3 真菌DNA提取

利用SDS方法［6］提取病原真菌总基因组DNA，其方法如下：（1）用灭菌的药匙收集菌丝到研钵中，加入DNA提取液开始研磨，研磨至无成型菌丝（研磨时间不可超过30 min），然后用移液枪分装于2 mL离心管中。（2）放入离心机进行离心（4℃，8 000 r/min）10 min，取出后重复1次。（3）把全部上层清液置于新的离心管中，加入0.5 mL异丙醇，上下震荡摇匀，放入离心机进行离心（4 ℃，12 000 r/min）10 min。（4）弃去上层清液，加入75 %酒精500 μL洗2 次。（5）弃去上层清液，静置风干，加入30 μL ddH2O溶解DNA，在室温静置1 h后轻轻摇动加入氯仿混匀后离心（12 000 r/min）1 min。（6）取上层清液于新的离心管中，加入清液1/10 倍体积的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，在-20℃放置20～30 min，然后离心（12 000 r/min）10 min。（7）加入50 μL 75%乙醇洗1～2次，风干，然后加入50 μL ddH2O，用于溶解DNA。（8）采用琼脂凝胶电泳检测DNA提取物。

1.4 病原菌的分子（ITS）鉴定

采用真菌通用引物［7］（I T S 1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 /ITS4：5'-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3'）对岗梅茎部真菌的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）为：上游引物（5 μmol/L）1 μL、下游引物（5 μmol/L）1 μL、Mix 12.5 μL、模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。

PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。

最后将PCR扩增片段送往北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。测序结果在GenBank（Http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）上进行BLAST同源性对比。

2 结果与分析

2.1 岗梅枝枯病的症状特点

从发病植株可见，岗梅茎部发病时枝条首先产生较小的褐色病斑，褐色病斑逐渐变成深褐色并有增大趋势，进而枝条上的叶片凋落，枝条干枯，严重时导致整株枯死（图1，彩插一）。

2.2 岗梅枝枯病分离物的致病性测定

将从岗梅茎部患病组织分离的真菌菌株进行致病性测定，结果显示，4个分离物当中，只有分离物二（图2，彩插一）在接种后14 d引起岗梅枝条出现深褐色病变（图3，彩插一），分离物一、三、四没有引起病害。从接种后岗梅发病枝条病健交界处的组织上再次分离纯化病原真菌，此菌的菌落形态和分子特征（ITS）与原分离物二的结果一致（图2、图4）。

图4 利用真菌通用引物ITS扩增的病原菌ITS片段

2.3 病原菌的分子（ITS）鉴定

利用真菌ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAG GTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3'）对病原真菌的rDNA内转录区进行扩增，获得片段大小约为600 bp的扩增产物（图5）。将扩增后得到的产物在GenBank中进行BLAST比对，结果显示，与岗梅枝枯病病原菌的ITS序列相似度在99 %以上的菌株（表1）均为葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea Ces.& DeNot.）。

图5 岗梅患病部位病原菌DNA经PCR扩增后的电泳结果

表1 病原菌ITS碱基序列在GenBank中的相似比较结果

3 结论与讨论

目前关于真核微生物的鉴定，通常利用其高度保守区rDNA间隔转录区间（ITS）特征进行鉴定。ITS之所以成为系统与进化研究中的重要分子标记，主要是因为：（1）作为18S～28S rDNA的一个组成部分，ITS 区在核基因中是高度重复的，而且通过不等交换或基因交换，这些重复单位间已发生了位点内或位点间的同步进化，即不同ITS拷贝间的序列趋于相近或完全一致，这就为对PCR扩增产物直接测序奠定了理论基础；（2）ITS区序列短，且ITS1、ITS2分别位于18S～5.8S、5.8S～28S rDNA之间，而18S、5.8S和28S rDNA的序列又非常保守，这就可以与它们序列互补的通用引物对ITS区进行PCR扩增和测序。目前研究中所用的引物即是White等［8］设计并通用于真核生物。利用通用引物对ITS区段进行PCR序列分析早已用于Verticillium dahliae和V. albo-atrum［9］、

Leptosphaeria maculans［10］和Fusarium sp.［11］的分类鉴定之中。本研究利用引物ITS4和ITS5扩增rDNA-ITS序列，通过比对，初步认为引起岗梅枝枯病的病原是葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea Ces. & DeNot.），这与袁勤峰等［4］报道的岗梅枝枯病病原（是胶孢炭疽菌复合种

Colletorichum gloeosprioides complex）不同，其原因可能是样本采集的地点和时间不同，也可能是引起岗梅枝枯病的病原存在多个种类，其原因有待进一步深入研究。

［1］ 江苏新医学院. 中药大辞典（上册）［M］. 上海：上海科学技术出版社，1986：1122.

［2］ 吴喜英，王明军，许为民. 复方岗梅合剂的临床疗效观察「J］. 时珍国医国药，2007，18（7）：1735.

［3］ 广东省食品药品监督管理局. 广东省中药材标准（第一册）［M］. 广州：广东科技出版社，2004：111-113.

［4］ 袁勤峰，郑露，刘浩，等. 广东岗梅枝枯病病原鉴定及生物学特性研究//中国植物病理学会2015年学术年会论文集［C］. 2015.

［5］ 方中达. 植病研究方法［M］. 第3版. 北京：中国农业出版社，1998.

［6］ Lee S B，Taylor J W. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores. In PCR protocols guide to methods and applications［J］. California：Academic Press，1990，7：282-287.

［7］ 周晓云，游春平. 红掌根腐病病原菌鉴定及其PCR检测方法［J］. 园艺学报，2013，40（5）989-996.

［8］ White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics，in Book：PCR -Protocols and Applications［J］. New Yorks：Academic Press，1990，38：315-322.

［9］ Nazar R N，Hu X，Schmidt J，et al. Potential use of PCR-amplified ribosomal intergenic sequences the detection and differentiation of Verticillium wilt pathogens［J］. Physio. Mol. Plant pathol，1991，39：1-11.

［10］ Xue B，Goodwin P H，Annis SL. Pathotype identification of Leptosphaeria maculans with PCR and oligonucleitide primers from ribosomal internal transcribed spacer sequences［J］. Physio. Mol. Plant pathol，1992，41：179-188.

［11］ Schilling A G. Polymerase chain reaction-based assays for species-specific detection of Fusarium culmorum，F. graminearum，and F. avenaceum［J］. Phytopathology，1996，86：515-522.

（责任编辑 杨贤智）

Identification of the pathogen causing branch blight of Ilex Asprella

HE Ling-bing1，WU Hui-ping2，YOU Chun-ping2，CHEN Bing-xu3，HAN Zheng-zhou4，XU Bing4，LAN Jin-Xu4，XING Jian-yong4
（1. State High-tech Industrial Innovation Center in Shenzhen，Shenzhen 518000，China；
2. College of Agriculture，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China；
3. Institute of Plant Protection，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China；
4. Sanjiu Medical and Pharmaceutical Co. Ltd，Shenzhen 518000，China）

Branch blight was a very important disease in Ilex asprella，occurring mainly in Pingyuan，Maoming of Guangdong province in recent years. Isolation and pathogenicity test of the pathogen of branch blight of I. asprella were carried out based on Koch’s postulation. For a molecular identification，18S-28S rDNA internal transcribed spacer（ITS）region was amplified from the pathogen with primers ITS1 and ITS4，obtaining a PCR product of 600 bp. A BLAST search in GenBank revealed the highest similarity（99%-100%）to the sequences of Botryosphaeria dothidea strains. Therefore，the pathogen causing branch blight of I. asprella was preliminarily identified as Botryosphaeria dothidea.

branch blight of Ilex asprella；pathogenicity test；pathogen identification；ITS

S435.67

A

1004-874X（2017）01-0111-04

2016-09-18

工业和信息化部中药材生产建设项目（［2014］737 号）

何凌冰（1966-），男，硕士，执业药师，E-mail: chengjn@stu.scau.edu.cn

游春平（1962-），男，博士，教授，E-mail：chunpingyou@sina.com

何凌冰，吴惠萍，游春平，等. 岗梅枝枯病病原鉴定［J］.广东农业科学，2017，44（1）：111-114.