田间烟蚜种群对3种杀虫剂抗性与酶活性关系的研究

张 超，刘童童，2，杨 洪，3，王 召，4，杨茂发，3

（1.贵州大学昆虫研究所，贵州 贵阳 550025；2.贵州省林业科学研究院，贵州 贵阳 550000；3.贵州大学烟草学院，贵州 贵阳 550025；4.凯里学院环境与生命科学学院，贵州 凯里 556011）

田间烟蚜种群对3种杀虫剂抗性与酶活性关系的研究

张 超1，刘童童1，2，杨 洪1，3，王 召1，4，杨茂发1，3

（1.贵州大学昆虫研究所，贵州 贵阳 550025；2.贵州省林业科学研究院，贵州 贵阳 550000；3.贵州大学烟草学院，贵州 贵阳 550025；4.凯里学院环境与生命科学学院，贵州 凯里 556011）

为了探讨烟蚜对杀虫剂抗性与酶活关系，就田间烟蚜种群对乐果、灭多威和阿维菌素3种杀虫剂的抗性与酶活性的关系进行研究。对具有不同抗性水平的几个田间烟蚜种群的酶活性测定结果显示：抗乐果、灭多威、阿维菌素品系中AchE、GSTs和CAT 3种酶的活性都高于敏感品系，其中抗乐果的兴仁和湄潭抗性品系AchE酶活性为敏感品系的1.212、1.588倍，GSTs酶活性为敏感品系的1.625、1.900倍，CAT酶活性是敏感品系的1.439、2.018倍；抗灭多威品系的清镇和湄潭抗性品系AchE酶活性为敏感品系的1.078、1.647倍，GSTs酶活性为敏感品系的 1.142、1.935倍，CAT酶活性为敏感品系的1.142、1.935倍；抗阿维菌素的兴仁和长顺抗性品系AchE 酶活性为敏感品系的1.370、1.664倍，GSTs酶活性为敏感品系的1.830、2.318倍，CAT酶活性为敏感品系的1.800倍、3.708倍。研究结果可为阐明田间烟蚜种群抗性产生机制提供参考。

烟蚜；抗药性；酶活性；乙酰胆碱酯酶；过氧化氢酶；谷胱甘肽S-转移酶

烟蚜Myzus persicae（Sulzer）又名桃蚜，属半翅目（Hemiptera）蚜科（Aphidiade）瘤蚜属（Myzus），是一种重要的农业害虫，更是烟草的主要害虫。烟蚜除吸取烟株汁液引起植株营养不良及生长畸形造成直接危害外，还可传播烟草黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y病毒（PVY）等多种烟草病毒病，对烟草造成更为严重的间接危害［1］。目前，在田间对烟蚜的综合治理中以化学防治为主，这也是农民选择的首要手段。但杀虫剂不合理使用和施药器械落后等原因使得烟蚜长期处于高选择和高残留环境中，加上烟蚜具有较强的环境适应能力和较短的生活史，敏感性快速减弱，耐药性问题亦日趋严重［2］。酶（Enzyme）是一类具有特定催化活性的蛋白质，昆虫的生命活动几乎都伴随着酶的反应。因此，对生物的酶系进行研究不仅对阐明生物生命现象的本质十分重要，也是阐明生物对逆境产生适应性机制的核心［3-4］。过去的研究表明，逆境胁迫下昆虫体内的主要酶系其活性和含量都会发生变化，这是昆虫抗性形成的重要生化机制［5］。郭天凤等和宋春满等对烟蚜的研究结果表明具有不同抗性水平烟蚜室内种群体内解毒酶活力有较大差异［6-8］，王泽华等和张鹏等对昆虫的研究结果也显示，不同龄期昆虫对杀虫剂敏感性不同［9-10］。虫态和杀虫剂敏感性水平是烟蚜防治适期选择、提高杀虫剂防效、治理和延缓耐药性的重要依据。

贵州省主要烟区的田间烟蚜种群已对乐果、灭多威和阿维菌素已产生低倍抗性［11］。本研究以田间烟蚜抗性种群为研究对象，测定已对乐果、灭多威和阿维菌素产生抗性的田间烟蚜种群体内的乙酰胆碱酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和过氧化氢酶（CAT）活性的变化，探索烟蚜对这3类杀虫剂产生抗药性的生化机制，并对二者间关系进行分析，旨在为贵州烟区烟蚜的田间有效防控和耐药性管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试虫源及饲养方法 相对敏感品系的烟蚜种群：采自长顺县马路乡烟叶生产基地，在不接触任何药剂的情况下已在实验室内连续饲养5年。饲养条件：温度：25（±1）℃、相对湿度：60%～70%、光周期14L∶10D。

抗性品系的烟蚜种群：选取对乐果具有抗性的两个田间烟蚜种群：湄潭抄乐烟蚜种群（对乐果抗性倍数为6.946倍）、兴仁四联烟蚜种群（对乐果抗性倍数为3.214倍），选取对灭多威具有抗性的两个田间烟蚜种群：湄潭抄乐烟蚜种群（对灭多威抗性倍数为5.05倍）、清镇流长烟蚜种群（对灭多威抗性倍数为2.616倍），选取对阿维菌素具有抗性的两个田间烟蚜种群：长顺改尧烟蚜种群（对阿维菌素抗性倍数为6.043倍）、兴仁四联烟蚜种群（对阿维菌素抗性倍数为2.952倍），以上烟蚜种群均于2013年7月采自贵州省烟田。

1.1.2 供试仪器 电子分析天平，德国Sartorious公司；电热恒温水温箱，北京永光明医疗仪器厂；电热鼓风干燥箱101-OA型，天津市泰斯特仪器有限公司；Haier冰箱，海尔集团；酶标仪，奥地利Tecan公司；试管、容量瓶等其他仪器均为国产；Sigma-3K30 高速冷冻离心机，德国Sartorious公司；移液枪，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；自动双纯水系统purelab plus p15123，Pall Comp（USA）公司；RGX250人工培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；755型紫外分光光度计。移液器 2.5、10、100、200、1000 μL，大龙兴创试验仪器（北京）有限公司50～300 μL八孔道移液器，大龙医疗设备（上海）有限公司

1.1.3 主要试剂 BCA蛋白浓度测定试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；乙酰胆碱酯酶测试盒，南京建成科技有限公司；谷胱甘肽-S转移酶测定试剂盒，南京建成科技有限公司；过氧化氢酶（Catalase CAT）测试盒，南京建成科技有限公司；氯化钠注射液（0.9%），贵州科伦药液有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酶液制备 分别取烟蚜敏感种群、湄潭抄乐烟蚜种群和兴仁四联烟蚜种群无翅成蚜10头，加入900 μL的生理盐水，用玻璃匀浆器置冰上匀浆，4℃条件下3 000 r/min离心10 min，取上清液为酶源液。

1.2.2 酶源蛋白含量测定 配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A，1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。将蛋白标准品按0、1、2、4、6、8、10μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，加灭菌双蒸水补足到10μL；取10μL待测样品加入96孔板。每个测定3次重复。向待测样品孔和蛋白标准品孔中加入200μL BCA工作液混匀。60℃温浴30 min，冷却至室温。

酶标仪562 nm波长下测定吸光度。以标准蛋白浓度为X轴，OD值为Y轴，制作蛋白质标准曲线，根据各样品的OD值，从标准曲线中求出样品浓度。

1.2.3 酶活性测定 乙酰胆碱酯酶（AchE）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和过氧化氢酶（CAT）3种酶的活性均采用南京建成科技有限公司的试剂盒进行测定。

采用Microsoft Excel 2007进行数据处理，采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 烟蚜对乐果的抗性与酶活性的关系

测定敏感品系烟蚜和田间抗乐果品系体内的乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和过氧化氢酶活性，结果（表1）表明，兴仁烟蚜与湄潭烟蚜品系均高于敏感品系体内的乙酰胆碱酯酶，比值分别为1.212和1.588。烟蚜体内谷胱甘肽S-转移酶活性测定结果显示，湄潭烟蚜品系最高，为敏感品系烟蚜的1.90倍，兴仁烟蚜品系较低为1.625倍。同理，兴仁烟蚜与湄潭烟蚜品系的过氧化氢酶活性分别是相对敏感品系的1.439倍和2.018倍。由此可见，随着3个烟蚜种群抗性水平的增加，其体内乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和过氧化氢酶3种酶活性均呈现升高趋势。表明烟蚜对乐果产生抗性后，其体内保护酶和解毒酶的活性增强。

表1 抗乐果烟蚜种群的3种酶活性比较

2.2 烟蚜对灭多威的抗性与酶活性的关系

测定敏感品系烟蚜和田间抗灭多威品系体内的乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和过氧化氢酶活性，结果（表2），清镇烟蚜与湄潭烟蚜品系均高于敏感品系体内的乙酰胆碱酯酶，比值分别为1.078和1.641。烟蚜体内谷胱甘肽S-转移酶活性测定结果显示，湄潭烟蚜品系最高，为敏感品系烟蚜的1.935倍，兴仁烟蚜品系较低为1.142倍。同理，兴仁烟蚜与湄潭烟蚜品系的过氧化氢酶活性分别是相对敏感品系的1.553倍和2.456倍。由此可见，随着3个烟蚜种群抗性水平的增加，其体内乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和过氧化氢酶3种酶活性均呈现升高趋势。表明烟蚜对灭多威产生抗性后，其体内保护酶和解毒酶的活性增强。

表2 抗灭多威烟蚜种群的3种酶酶活性比较

2.3 烟蚜对阿维菌素的抗性与酶活性的关系

测定敏感品系烟蚜和田间抗阿维菌素品系体内的乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和过氧化氢酶活性，结果（表3）表明，兴仁烟蚜与长顺烟蚜品系均高于敏感品系体内的乙酰胆碱酯酶，比值分别为1.370和1.664。烟蚜体内谷胱甘肽S-转移酶活性测定结果显示，长顺烟蚜品系最高，为敏感品系烟蚜的2.318倍，兴仁烟蚜品系较低为1.830倍。同理，兴仁烟蚜与湄潭烟蚜品系的过氧化氢酶活性分别是相对敏感品系的1.800倍和3.708倍。由此可见，随着3个烟蚜种群抗性水平的增加，其体内乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和过氧化氢酶3种酶活性均呈现升高趋势。表明烟蚜对阿维菌素产生抗性后，其体内保护酶和解毒酶的活性增强。

表3 抗阿维菌素烟蚜种群的3种酶酶活性比较

3 讨论

害虫对杀虫剂产生抗药性是不断适应杀虫剂的过程。昆虫的一切生命活动均有酶的参与，当药剂进入虫体内，经过体内酶的氧化、还原、水解或结合后，降低其毒性，或增强其水溶性，将其排出体外，达到解毒目的［12-13］。研究发现在杀虫剂的选择压力下，昆虫体内解毒酶酶活性产生了相应的变化，导致抗性昆虫中解毒酶酶活性有所增高，引起了害虫对杀虫剂抗性的产生［14］。李周直等用药剂处理褐刺蛾和褐边绿刺蛾后发现虫体内保护酶的活性均高于敏感体系，推测昆虫体内的保护酶的变化与产生抗药性有很大的关系［15］。由此可见昆虫体内酶活性的变化是昆虫产生抗药性的原因之一。

Smissaert首先在二斑叶螨Tetranychus urticae上发现了导致对杀虫剂不敏感的AChE变构［16］，随后在许多种昆虫中如家蝇（Musca domestica）、按蚊（Anopheles）、小菜蛾（Plutella xylostella）和棉蚜（Aphis gossypii）等昆虫中陆续发现了不敏感AChE的存在［17］。除了酶性质发生改变外，昆虫也可通过AChE基因表达量的增加而对杀虫剂产生抗性。在AChE所介导的抗性机理研究中，还有另一些原因如AChE活性的增加、AChE酶量的增加都可能与昆虫抗性水平成正比［18-19］。本研究通过对具有不同抗性水平的几种烟蚜种群的乙酰胆碱酯酶活性测定结果显示，部分抗性品系的AChE活性与敏感品系有显著性差异，有的差异不显著。但是随着抗性提高，AChE的活性都有一定程度的提高。这可能与杀虫剂的种类有关，大量的研究表明，AChE对有机磷和氨甲基酸酯类杀虫剂敏感性的降低是昆虫对这些杀虫剂产生抗性的重要机理之一。

谷胱甘肽S-转移酶是昆虫对杀虫剂产生抗性的重要因素，在保护组织以抵御氧化侵害及氧化压力中起重要作用。本研究中3种杀虫剂的抗性品系中，所有抗性烟蚜品系的GSTs的活性均显著高于相对，GSTs的活性明显高于敏感品系烟蚜的GSTs活性，并且同一杀虫剂的抗性烟蚜品系之间，GSTs的活性亦达到显著水平。抗性品系中GSTs活性提高，这在其他的抗性昆虫中也呈现相同的规律［20-21］。说明GSTs可能是是昆虫产生抗性的一个很重要的因素。

过氧化氢酶作为生物体内重要物质，具有非常重要的生理功能，其中最为主要的就是参与活性氧代谢过程。李周直等证明菜粉蝶、刺蛾体内CAT与它们的耐药性有关［15］。陈尚文认为马尾松毛虫体内CAT与其耐药性存在一定的相关性［22］。吴小锋等发现家蚕血液CAT 与蚕体抗逆性有一定的相关性［23］。徐欣等用敌敌畏和高效氯氰菊酯杀虫剂在不同抗性选育方式下对家蝇抗药性发展和CAT活性变化的作用，经处理后CAT活性均有不同程度的增加［24］。在本实验中乐果和灭多威的抗性品系中，所有抗性烟蚜品系的CAT的活性均显著高于相对敏感品系烟蚜的CAT活性，并且同一杀虫剂的抗性烟蚜品系之间，CAT的活性差异性亦达到显著水平；在阿维菌素的抗性品系中，长顺烟蚜品系的CAT活性与其他两个烟蚜品系的CAT活性差异显著；相对敏感品系烟蚜的CAT活性与兴仁烟蚜品系的CAT活性差异不显著。

本研究对具有不同抗性水平的田间烟蚜种群的酶活性进行测定表明，对乐果、阿维菌素、灭多威具有抗性的烟蚜种群所测定的3种酶活性均比敏感品系高，由次可见当烟蚜对药剂抗性增强时烟蚜体内的AchE、GSTs和CAT 3种酶的酶活性均比敏感品系高，而且酶活性随着抗性的增强呈正相关关系。由于所选取的田间烟蚜种群对这3种杀虫剂的抗性都是低倍抗性或者只是敏感性降低。因此，需要继续监测这些烟蚜种群对杀虫剂抗性变化，进一步研究以上3种酶的活性变化的分子机制，才能探明田间烟蚜种群对这3种杀虫剂产生抗性的机理，为田间烟蚜防控的用药策略提供参考。

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（责任编辑 杨贤智）

Relationship between three insecticides resistance and enzyme activity in natural population of Myzus persicae（Sulzer）

ZHANG Chao1，LIU Tong-tong1，2，YANG Hong1，3，WANG Zhao1，4，YANG Mao-fa1，3
（1. Institute of Entomology，Guizhou University，Guiyang 550025，China；
2. Guizhou Academy of Forestry Science，Guiyang 550000，China；
3. College of Tobacco Science， Guizhou University，Guiyang 550025，China；
4. School of Environment and Life Sciences，Kaili College，Kaili 556011，China）

In order to explore the relationship between insecticide resistance and enzyme activity in natural population of Myzus persicae（Sulzer），we studied the activities of Ache，GST and CAT in M. persicae（Sulzer）insecticide resistance to dimethoate，methomyl and avermectins. The results showed that，the resistance stains（different regions）of dimethoate，methomyl and avermectins had higher enzyme activity of AchE，GSTs and CAT than susceptible strain. For the resistance stain of dimethoate，the enzyme activities of AchE in Xingren and Meitan resistant strain were 1.212 times，1.588 times than susceptible strain；the enzyme activities of GSTs resistant strain were 1.625 times，1.900 times than susceptible strain，and the enzyme activities of CAT resistant strain were 1.439 times and 2.018 times than susceptible strain. For the resistance strain of methomyl，the enzyme activities of AchE in Qingzhen and Meitan resistant strain were 1.078 times 1.647 times than susceptible strain；the enzyme activities of GSTs resistant strain were 1.142 times，1.935 times than susceptible strain，and the enzyme activities of CAT resistant strain were 1.142 times，1.935 times than susceptible strain. Forthe resistance strain of avermectins，the enzyme activities of AchE in Xingren，Changshun resistant strain were 1.370 times，1.664 times than susceptible strain；the enzyme activities of GSTs resistant strain were 1.830 times，2.318 times than susceptible strain，and the enzyme activities of CAT resistant strain were 1.800 times，3.708 times than susceptible strain. The results provide a reference for elucidating the field resistance mechanism of M. persicae（Sulzer）population.

Myzus persicae；insecticide resistance；enzyme activity；AChE；CAT；GST

S435.72

A

1004-874X（2017）01-0100-06

2016-10-10

中国烟草总公司贵州省公司科技项目（201022）

张超（1992-），男，在读硕士生，E-mail：zc0178sfp@163.com

杨洪（1975-），男，博士，教授，E-mail：agr.hyang@gzu.edu.cn

张超，刘童童，杨洪，等. 田间烟蚜种群对3种杀虫剂抗性与酶活性关系的研究［J］.广东农业科学，2017，44（1）：100-105.