潜在促生菌Bacillus tequilensis U36的产IAA特性及其对辣椒的促生效果

聂 鑫，王 伟

（华东理工大学生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

潜在促生菌Bacillus tequilensis U36的产IAA特性及其对辣椒的促生效果

聂 鑫，王 伟

（华东理工大学生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

对从土壤中分离到的一株潜在根围促生菌U36进行了系统分析，通过形态学、生理生化特性及16S rRNA分析鉴定其为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis。盆栽试验发现，U36对植物生长有促进作用，而且在正常土壤中植株的生长优于无菌土。但就促生效率而言，在灭菌土中加入U36后的促生效率高于正常土中的促生效率：正常土中U36对辣椒根长、根重、茎长、茎重和叶面积的促进效率分别达到47.7%、37.5%、21.5%、69.2%和8.1%；而在灭菌土中，辣椒根长、根重、茎长、茎重和叶面积的促进效率分别为49.2%、58.8%、25.7%、58.2%和24.1%。通过研究发现U36不仅具有固氮、解磷的功能，还可产生促生长物质吲哚乙酸（IAA），且IAA的产生具有色氨酸依赖性。该菌株的优良促生特性可以作为潜在促生菌用于生物肥料研发，具有很好的应用价值。

辣椒；促生菌；Bacillus tequilensis；吲哚乙酸；色氨酸依赖性

植物根围促生菌（PGPR）是一类在土壤中与植物密切相关的重要微生物，这些微生物的生长活动可以促进宿主植物的生长［1］。自然界中的PGPR种类很多，有些微生物具有直接促进植物生长的功能，如Goswami等［2］研究的Paenibacillus mucilaginosus N3；有些微生物的促生作用机制是基于对一些植物病原菌的拮抗，如我们常见的一些荧光假单胞菌和芽孢杆菌都具有生物防治的效果，从而促进植物生长［3］。对于PGPR的研究和应用一直在不断发展，特别是近几年随着人们生活水平的不断提高、环保意识的增强以及对化学肥料危害的深入了解，安全无污染的生物农药和生物肥料成为研究重点。Gopalakrishnan等研究的放线菌对水稻的促生作用［4］以及Paungfoo-Lonhienne等研究的伯克氏菌属的促生作用［5］都为PGPR的发展和应用奠定了重要基础。

PGPR的促生机制有多方面，大多数PGPR的促生作用是多种促生机制共同作用的结果。有的菌株具有固氮、解磷和解钾的功能，从而为宿主植物提供N、P、K等营养元素；有的则通过产生一些促生长的物质如吲哚乙酸（IAA）、氢氰酸、铁载体等［6］来达到促进植物生长的效果。这些促生机制在很多研究中被用来筛选PGPR，为后续的生物测定以及田间试验提供参考。IAA是一种常见的植物促生长激素，很多PGPR都可以产生该类物质，但是产生的方式有所不同。Idris等［7］对Bacillus amyloliquefaciens FZB4 产生IAA的机理进行了深入研究，发现其具有色氨酸依赖性。目前，对PGPR促生作用的研究很多，但是就PGPR在正常土壤环境和无菌土壤环境中促生效果的比较研究还未见报道。鉴于此，本研究基于实验室内筛选到的可能具有促生潜力的菌株Bacillus tequilensis U36（简称U36），对它产生IAA的色氨酸依赖性及其在正常土与无菌土中的促生效果进行初步比较，目的是对该菌株可能作为潜在生物肥料的有效成分提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株：U36分离自施入了生防菌荧光假单胞菌CPF10的西瓜根围土壤中。

辣椒：朝天椒（Capsicum frutescens），种子购于徐州一粒籽园艺有限公司。

土壤：上海市亭林地区蔬菜大棚内的辣椒种植土壤，pH 7.76（±0.20），总氮1.23（±0.08）g/kg，有机碳10.41（±1.08）g/kg，有机质1.77（±1.44）g/kg，砂粒（50～2000 μm）17.18%，粉粒（2～50 μm）79.76%，粘粒（＜2 μm）3.16%，土壤质地为黄壤土。土壤取回后自然晾干，过2 mm筛，部分土壤需灭菌处理，灭菌方法参照Delmont等［8］，灭菌后的土壤放置1周后使用。

1.2 试验方法

试验于2014年9月在华东理工大学生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室内进行。

1.2.1 U36的鉴定 （1）形态学鉴定和生理生化鉴定：参照文献［9］和文献［10］进行鉴定。（2）分子生物学鉴定：将菌株用LB液体培养液培养至对数生长期，离心收集菌体，采用SDS-CTAB法提取总基因组DNA。以总DNA为模板，采用通用引物27F（5＇-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3＇）和1492R（5＇-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3＇）进行16S rRNA的PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后纯化回收并测序（上海生工生物工程科技有限公司），获得16SrRNA序列后，在GenBank中采用Blast程序搜索同源序列，利用MEGA 4.0软件建立系统进化树。

1.2.2 菌株U36促生长作用 试验设4个处理：（1）灭菌土添加U36；（2）正常土添加U36；（3）灭菌土未添加U36（CK1）；（4）正常土未添加U36（CK2）。每个处理3次重复。辣椒种子先用70%乙醇消毒2 min，再用次氯酸钠溶液处理2 min，最后用无菌水冲洗10次。将处理后的种子，在无菌水中浸泡1 h后播种于圆形花盆（盆口×盆底×盆高=100 mm×70 mm ×95 mm）中，花盆内含有500 g土，初始含水量为10%（V/W），置于人工植物培养箱（温度24℃、相对湿度70%、光照12 h/d）中，每隔2 d浇水1次，每次约50 mL，花盆底部放置浅碟，以防止菌淋滤出。试验菌株U36培养于LB液体培养基中，37℃振荡培养24 h，菌液离心沉淀后用无菌水稀释，使最终加入的试验菌量为1×108CFU/g（按干土量计），播种后将菌液通过灌根的方式加入到土壤中。处理后第40天对辣椒植株进行取样，测量根重、茎重、根长、茎长和叶面积等生理指标。

1.2.3 菌株U36固氮作用 配制Ashby无氮培养基（KH2PO40.2 g/L、CaCO30.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、NaCl 0.2 g/L、CaSO40.1 g/L、葡萄糖10 g/L、琼脂20 g/L，pH 7.0），从LB固体培养基上挑取U36菌株的单菌落在Ashby无氮培养基固体平板上划线，3次重复，37℃培养箱内培养24 h后进行观察。如果可以生长，则该菌株可以利用空气中的氮气使自己在无氮培养基中生长，具有固氮能力。

1.2.4 菌株U36解磷作用 配制PVK改良培养基〔葡萄糖10 g/L、Ca3PO45 g/L、（NH4）2SO40.5 g/L、NaCl 0.2 g/L、MgSO40.1 g/L、KCl 0.2 g/L、酵母粉0.5 g/L、MnSO40.002 g/L、4%溴酚蓝6 mL、琼脂20 g/L、pH自然〕，从LB固体培养基上挑取U36菌株单菌落涂于PVK改良培养基固体平板上，3次重复，37℃培养箱内培养24 h后进行观察。如果菌落周围可以产生透明圈，说明该菌株可以溶解不溶的磷酸钙产生磷元素供菌体生长，具有解磷作用。

1.2.5 菌株U36解钾作用 配制解钾培养基（蔗糖5 g/L、Na2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeCl30.005 g/L、CaCO30.1 g/L、钾长石粉1 g/L、琼脂20 g/L、pH 7.0～7.5），从LB固体培养基上挑取U36菌株单菌落涂于解钾培养基固体平板上，3次重复，37℃培养箱内培养24 h后进行观察。如果周围有透明圈产生，说明该菌株可以溶解不溶的钾长石产生钾元素供菌体生长，具有解钾作用。

1.2.6 菌株U36产IAA特性 绘制IAA标准曲线：取IAA标品，配置成0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μg/mL的浓度梯度，取2 mL各浓度IAA加入4 mL索尔克染剂（1 mL 0.5 mol/L FeCl3·H2O加入到50 mL 35%浓H2SO4中），30℃中暗保温30 min，530 nm下利用分光光度计测定吸光度，以OD值为纵坐标、IAA浓度为横坐标绘制标准曲线。

将U36与实验室分离到的另外两种菌株U12和U40作为对照菌株同时进行试验。首先，将3种菌株单菌落接种到LB液体培养基中，加入5 mmol/L L-色氨酸、0.06%SDS（十二烷基硫酸钠）和1%甘油，37℃下180 r/min振荡培养48 h。取菌液于离心管中10 000 r/min离心5 min，取2 mL上清，加入2滴磷酸和4 mL索尔克染剂。28℃下30 min左右颜色由黄色变为粉红色则说明显阳性，检测到有IAA的产生，并根据标准曲线计算产生的IAA含量。

1.2.7 菌株U36产IAA的色氨酸依赖性 将菌株U36、U12和U40分别接种到LB液体培养基中，置于37℃下180 r/min恒温振荡培养箱内培养24 h后作为母液使用。取1 mL菌液接种到新的100 mL LB液体培养基中，设0、250、500 μg/mL L-色氨酸3个处理，每个处理3次重复。处理后同样条件下振荡培养，分别在培养后0、1、2、3、4、5 d时取样，每个样品3次重复。然后进行IAA色氨酸依赖性检测，分别取上述菌液于离心管中10 000 r/min离心5 min，取2 mL上清，加入2滴磷酸和4 mL索尔克染剂，28℃下30 min左右颜色由黄色变为粉红色则说明显阳性，检测到有IAA的产生，测定530 nm下的吸光度，根据标准曲线计算IAA浓度。

1.3 数据统计分析

利用SPSS软件对试验数据进行方差分析，检验其差异显著性。

2 结果与分析

2.1 菌株U36的鉴定

菌株U36的形态学鉴定及生理生化鉴定结果表明，U36在培养基中呈白色、干燥、粗糙、无光泽状态，电子显微镜下观察为杆状，且为革兰氏阳性。生理生化鉴定发现U36可水解葡萄糖、蔗糖、明胶、淀粉，但不水解乳糖和柠檬酸，甲基红试验阳性说明该菌株水解葡萄糖产生丙酮酸并最终被分解为甲酸、乙酸和乳酸等。

对U36进行分子生物学鉴定，16SrRNA测序结果采用MEGA 4.0软件构建系统发育树（图1）。将16SrRNA的测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较，发现该菌株序列（GenBank登陆号为HQ223107）与Bacillus tequilensis（10 b）同源性达99.887%，结合生理生化特征，确定菌株U36为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis。

图1 U36的系统发育树

2.2 菌株U36的促生作用

在辣椒生长40 d时测定各项生理指标，结果见表2。由表2可知，U36在正常土和灭菌土中与对照的各个生理指标差异显著，正常土壤中植株的生长状况优于灭菌土，但促生效率不同。正常土中U36对根长的促进效率达47.7%，根重促进效率达37.5%，茎长促进效率达21.5%，茎重促进效率达69.2%，叶面积促进效率只有8.1%；而在灭菌土中根长、根重、茎长、茎重和叶面积的促进效率分别为49.2%、58.8%、25.7%、58.2%和24.1%。由此可见，无论是U36处理还是非U36处理中，正常土中的植株生长状况都比灭菌土中好，在根长、茎长、茎重和叶面积上都有显著差异。但就总体促生效率而言，在灭菌土中加入U36后的促生效率比正常土中要高，说明U36具有促进植物生长的作用，发挥着重要的生态功能。

表2 U36在正常土与灭菌土中对辣椒生长情况的影响

2.3 菌株U36的固氮、解磷和解钾特性

通过对U36固氮、解磷、解钾特性的研究，发现U36表现出了一定的固氮作用和解磷作用，但不具有解钾的特性。具有固氮和解磷作用可能是U36表现出促生特性的一个重要原因。

2.4 菌株U36的产IAA特性

IAA的标准曲线如图2所示。通过对发酵液中的IAA进行检测发现，菌株U36和两个对照菌株都可产生IAA，但产量不同。在该处理条件下，U12的IAA产量只有22.5（±2.3）μg/mL，U40的IAA产量有58.1（±3.2）μg/mL，而U36的IAA产量达到63.1（±3.7）μg/mL。可见，在这3种菌株中U36的IAA产量最大。

图2 IAA标准品标准曲线

图3 U36产生IAA的浓度随发酵时间的变化

对U36产IAA的色氨酸依赖性试验结果见图3。对0、1、2、3、4、5 d的样品进行IAA检测的结果表明，该菌株在没有色氨酸存在的情况下，代谢产物基本检测不到IAA的产生，而在色氨酸浓度为250、500 μg/mL时可以检测到IAA的产生。在500 μg/mL色氨酸浓度下，发酵2 d即可达到较高的IAA浓度，然后趋于平缓，而在250 μg/mL色氨酸浓度下约4 d才能达到较高IAA浓度，然后趋于平缓，这可能是培养基中的色氨酸已被完全利用而导致IAA的生成终止，IAA浓度基本保持不变。可见，在高色氨酸浓度条件下生成IAA的效率及其产量可能会更高。

3 结论与讨论

PGPR研究是近几年热点，越来越多的PGPR菌株被分离出来，利用其促进植物生长的特性被广泛应用于不同地域、不同环境下的农业生产［11-12］。在PGPR促生机制的研究中，IAA是一种重要的植物激素，是很多PGPR促生特性的重要原因［13］。我们发现本实验室分离到的U36菌株可以产生IAA，且具有色氨酸依赖性，即在有色氨酸存在的条件下可利用色氨酸产生IAA，且在高色氨酸浓度条件下IAA的生成效率也会提高。这一特性在其他PGPR的研究中也被发现［14-15］，有学者认为这可能与菌株产生IAA时的一些关键酶的表达有关［16］。因此，在应用时若补充一些关键氨基酸，其在土壤中将发挥更好的促生效果。

U36的促生效果不论在正常土还是无菌土盆栽试验中的表现都十分突出，这可能源于U36的优良促生特性。产生的IAA直接促进植物生长，固氮特性使其获得更多的氮源供植物利用，解磷作用帮助植物利用土壤中难以利用的磷元素。我们还发现，植物在正常土中的生长比在无菌土中的生长状态好，这与国内外一些学者研究的结果有一定的相似性［17］，原因可能有以下几个方面：首先，我们的研究用土取自蔬菜大棚内的土壤，该土壤环境可能更利于植物的生长，土壤中的很多有益微生物都与植物生长密切相关，所以相同的条件下正常土比无菌土中的植株生长较好；其次，在加入U36以后，U36不仅自身可以产生一些促生长物质直接作用于植物本身，而且可以与土壤中的微生物相互作用，可能增加了有益菌群的数量，同时减少了有害菌群的数量，所以有菌土中辣椒的生长状况比无菌土好，Wu等［18］的研究也得到相似结果。在无菌土的条件下，U36表现出的促生效率比正常土更好，可能是在无菌土条件下辣椒本身长势较差，当U36加入后很快定殖，其对植物直接的促生作用得到加强，从而表现出更高的促生效率。

然而，也有少量PGPR的研究与本研究结果不同［19］，他们认为土壤灭菌彻底消除了土壤中的不利生物因素外，高温灭菌也会使土壤中的某些缓效养分得到释放［20］，从而使植株的生长得到显著改善。这种差异可能与研究所用土壤和所用植株的不同有关，不同的研究土壤，其中的微生物群落对不同的植株生长的影响不同。如果土壤原本不利于植物生长，灭菌处理可能会杀灭土壤中的有害菌群；但如果土壤原本的微生物菌群是有利于植物生长的，灭菌处理可能会杀灭大量的有益菌群，从而降低了土壤活力。

［1］ Chauhan H，Bagyaraj D J，Selvakumar G，et al. Novel plant growth promoting rhizobacteria—Prospects and potential［J］. Applied Soil Ecology，2015，95：38-53.

［2］ Goswami D，Parmar S，Vaghela H，et al. Describing Paenibacillus mucilaginosus strain N3 as an efficient plant growth promoting rhizobacteria（PGPR）［J］. Cogent Food & Agriculture，2015，1（1）：1000714.

［3］ Sivasakthi S，Usharani G，Saranraj P. Biocontrol potentiality of plant growth promoting bacteria（PGPR）-Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis：A review［J］. African Journal of Agricultural Research，2014，9（16）：1265-1277.

［4］ Gopalakrishnan S，Vadlamudi S，Bandikinda P，et al. Evaluation of Streptomyces strains isolated from herbal vermicompost for their plant growthpromotion traits in rice［J］. Microbiological Research，2014，169（1）：40-48.

［5］ Paungfoo-Lonhienne C，Lonhienne T G A，Yeoh Y K，et al. A new species of Burkholderia isolated from sugarcane roots promotes plant growth［J］. Microbial Biotechnology，2014，7（2）：142-154.

［6］ Ma Y，Prasad M N V，Rajkumar M，et al. Plant growth promoting rhizobacteria and endophytes accelerate phytoremediation of metalliferous soils［J］. Biotechnol Adv，2011，29（2）：248-258.

［7］ Idris E S E，Iglesias D J，Talon M，et al. Tryptophan-dependent production of indole-3-acetic acid（IAA）affects level of plant growth promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42［J］. Mol Plant Microbe Interact，2007，20（6）：19-26.

［8］ Delmont T O，Francioli D，Jacquesson S，et al. Microbial community development and unseen diversity recovery in inoculated sterile soil［J］. Biology and Fertility of Soils，2014，50（7）：1069-1076.

［9］ 东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001.

［10］ 布坎南，吉本斯. 伯杰细菌鉴定手册［M］. 第8版. 北京：科学出版社，1984.

［11］ Nadeem S M，Ahmad M，Zahir Z A，et al. The role of mycorrhizae and plant growth promoting rhizobacteria（PGPR）in improving crop productivity under stressful environments［J］. Biotechnology Advances，2014，32（2）：429-448.

［12］ Shinwari K I，Shah A U，Afridi M I，et al. Application of plant growth promoting rhizobacteria in bioremediation of heavy metal polluted soil［J］. Asian Journal of Multidisciplinary Studies，2015，3（4）：179-185.

［13］ Duca D，Lorv J，Patten C L，et al. Indole-3-acetic acid in plant-microbe interactions［J］. Antonie Van Leeuwenhoek，2014，106（1）：85-125.

［14］ Bano N，Musarrat J. Characterization of a new Pseudomonas aeruginosa strain NJ-15 as a potential biocontrol agent［J］. CurrentMicrobiology，2003，46（5）：324-328.

［15］ Atzorn R，Crozier A，Wheeler C T，et al. Production of gibberellins and indole-3-acetic acid by Rhizobium phaseoli in relation to nodulation of Phaseolus vulgaris roots［J］. Planta，1988，175（4）：532-538.

［16］ Oberhänsli T，Défago G，Haas D. Indole-3-acetic acid（IAA）synthesis in the biocontrol strain CHA0 of Pseudomonas fluorescens：role of tryptophan side chain oxidase［J］. Journal of General Microbiology，1991，137（10）：2273-2279.

［17］ 张晓霞，王平. 对水稻有促生作用的紫云英根瘤菌筛选初报［J］. 土壤肥料，2001（6）：30-33.

［18］ Wu K，Yuan S，Wang L，et al. Effects of bioorganic fertilizer plus soil amendment on the control of tobacco bacterial wilt and composition of soil bacterial communities［J］. Biology and Fertility of Soils，2014，50（6）：961-971.

［19］ 张树生，杨兴明，茆泽圣，等. 连作土灭菌对黄瓜（Cucumis sativus）生长和土壤微生物区系的影响［J］. 生态学报，2007，27（5）：1809-1817.

［20］ Troelstra S R，Wagenaar R，Smant W，et al. Interpretation of bioassays in the study of interactions between soil organisms and plants：involvement of nutrient factors［J］. New Phytologist，2001，150（3）：697-706.

（责任编辑 张辉玲）

IAA production characteristics and growth-promoting effects on pepper of potential plant grouth-promoting rhizobacteria（PGPR）Bacillus tequilensis U36

NIE Xin1，WANG Wei
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，School of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

We systematically analyzed a potential plant growth-promoting rhizobacteria（PGRP）U36，which was separated from soil. This strain was eventually determined to be Bacillus tequilensis through the morphological，physiological and biochemical properties and 16S rRNA assay. Through the pot experiment，we found that U36 promoted pepper growth，which was better in normal soil than in sterilized soil，but the growth promoting efficiency was much higher in sterilized soil than in normal soil after applying U36. In normal soil，the promoting efficiencies of U36 on root length，root weight，stem length，stem weight and leaf area of pepper were 47.7%，37.5%，21.5%，69.2% and 8.1%，respectively. While in sterile soil，the promoting efficiencies were 49.2%，58.8%，25.7%，58.2% and 24.1%，respectively. Besides，U36 not only had the functions of nitrogen fixation and phosphate-solubilizing，but also could produce the growth promoting substance IAA，and the generation of IAA had tryptophan dependence. With the excellent growth-promoting effect，U36 can be used as a potential PGPR for the development of biological fertilizer，which has a good application value.

pepper；plant growth-promoting rhizobacteria（PGPR）；Bacillus tequilensis；IAA；tryptophan dependence

S758.2

A

1004-874X（2017）01-0036-07

2016-10-28

上海市科技创新行动计划重点攻关项目（15391901500）

聂鑫（1990-），男，在读硕士生，E-mail：niexin19901203@sina.com

王伟（1963-），男，博士，教授，E-mail：weiwang@ecust.edu.cn

聂鑫，王伟. 潜在促生菌Bacillus tequilensis U36的产IAA特性及其对辣椒的促生效果［J］.广东农业科学，2017，44（1）：36-42.