我国奶牛牛支原体流行情况调查

张建华，曹希亮，刘超，郝永清

(1.内蒙古农业大学兽医学院、农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室、内蒙古预防重点实验室，呼和浩特 010018；2.拜耳（四川）动物保健有限公司 610225)

我国奶牛牛支原体流行情况调查

张建华1，曹希亮2，刘超2，郝永清1

(1.内蒙古农业大学兽医学院、农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室、内蒙古预防重点实验室，呼和浩特 010018；2.拜耳（四川）动物保健有限公司 610225)

由牛支原体引起的奶牛支原体肺炎和乳房炎所导致的经济损失非常巨大，而目前我国尚无较详细的奶牛牛支原体病流行病学资料。2008～2016年，本课题组采用牛支原体间接ELISA、直接培养法和特异性PCR检测法对国内12个地区30个规模化奶牛场进行了牛支原体感染情况调查及分析，共对843份血清和60份肺脏、关节液及鼻腔黏液、1 090份乳样中的牛支原体抗体和牛支原体及其核酸进行了检测。结果显示，血清抗体阳性率为52.31%（441/843）；病料阳性率为55%（33/60）；乳样阳性率为34.22%（373/1090）；从样本中共分离保存了55株支原体菌种。检测结果表明，国内大部分奶牛场存在牛支原体感染，部分奶牛场发生牛支原体肺炎、乳房炎及关节炎临床病例，并存在垂直传播的风险。牛支原体感染可能成为危害国内规模化奶牛场奶牛健康的主要疫病之一。

牛支原体；奶牛；流行情况调查

牛支原体（Mycoplasma bovis）是危害养牛业的重要致病性支原体，除导致牛乳房炎外，还导致关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种病症[1]。1961年美国首次从乳房炎患牛中分离到牛支原体，1976年报道该病原与牛呼吸系统疾病有关。在欧洲，25%～33%的犊牛肺炎由牛支原体引起，每年损失1.44亿～1.92亿欧元[2]。在美国，每年因牛支原体感染导致的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成的损失达1.40亿美元。在我国，有关奶牛支原体方面的疾病报道较少。2008年以后，我国许多地区相继散发以坏死性肺炎为主要病变的犊牛肺炎病例，辛九庆[3]、石磊[4]、冉智光[5]等人从患病动物上分离并鉴定出牛支原体，患病牛群发病率50%～100%，患病牛死亡率10%～50%。本课题组于2008～2016年对国内12个地区30个规模化奶牛场的牛支原体感染情况进行了调查分析，以期为我国奶牛牛支原体的流行病学调查及相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2008年9月～2016年5月，在全国12个地区30个规模化奶牛场采集6月龄以下犊牛血清843份、肺炎死亡犊牛肺脏病料17份、具有肺炎症状的犊牛鼻腔拭子30份、膝关节明显肿大的关节液13份、临床难治性乳房炎患牛乳样1 090份。

1.2 试剂

牛支原体间接ELISA试剂盒，购自加拿大Biovet公司。

1.3 培养基

基础培养基：PPLO肉汤粉21g，葡萄糖1g，0.4%酚红2.5mL，25%酵母浸液10mL，充分溶解定容至800mL，用1mol/L NaOH调pH值至7.6～7.8，121℃灭菌15min，4℃保存（可保存2周）。

完全培养基：基础培养基使用时加入200mL的灭活马血清、终浓度为100U/mL的青霉素以及终浓度为1g/L的丙酮酸钠。配制固体培养基时，高压前再加入10g琼脂粉，灭菌后温度降至50℃时再加入后续的添加剂。

1.4 间接ELISA检测

按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.5 PCR检测

1.5.1 病料的处理

取病料无菌接种牛支原体液体培养基，置5% CO2培养箱37℃培养48h，将培养物再接种1次培养基，每天观察培养基颜色变化，取培养管颜色变化且底部有浑浊的培养管离心，从沉淀中粗提牛支原体核酸。

1.5.2 乳样的处理

用灭菌棉签蘸取乳样涂于支原体固体培养基，72h后进行观察，如果见到针尖状菌落，挑去菌落进行纯化，用试剂盒提取核酸。

1.5.3 模板的制备

取3mL培养物15 000r/min离心20min，弃上清，用0.1mol/L PBS反复冲洗2次，加入50μL PBS悬浮沉淀

并置于沸水中煮沸10min，立即冰浴，3000r/min离心10min，将上清吸入另一个离心管，作为DNA模板。

1.5.4 PCR 反应

参考本实验室检测牛支原体特异性序列和牛支原体16S rDNA引物进行PCR。引物序列见表1。

表1 引物列表

25μL 反应体系：模板3μL、P1和P2各0.5μL（10μmol/L）、dNTPs（2.5mmol/L）2.0μL、PCR 10×buffer 2.5μL、Taq 酶0.5μL（2.5U/μL）、ddH2O 16μL。优化的PCR 扩增条件：94℃预变性5min；95℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，4℃条件下保存。回收16S rDNA PCR产物并送上海生工生物工程有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 各地区牛支原体血清学检测结果

调查结果表明，6个地区的6个规模化奶牛场均存在牛支原体感染，感染率为16.16%～84.6%，表明感染地区分布广、感染率高（表2）。2010年，李大伟等[6]对我国14个省的牛群进行的支原体流行病学调查显示，牛场群抗体阳性率为84.4%，个体阳性率为47.8%, 其中肉牛（52%）和奶牛（61.2%）个体阳性率较高，而牦牛个体阳性率（14.2%）较低，本次调查结果与此相似。调查发现，这些地区奶牛感染的多是牛支原体肺炎，可能与近几年从国外大量引进奶牛有一定的关系，因此，有必要对进口的奶牛和冻精进行牛支原体检疫。

表2 牛支原体血清学检测结果

2.2 牛病料及奶样PCR检测结果

用牛支原体特异性引物PCR 检测M.bovis阳性DNA和1 150份病料，结果显示，从406份病料均扩增出约442bp大小的片段，与预期扩增片段相符，阴性对照未见特异性条带（图1）。不同来源病料的牛支原体PCR检测结果见表3。表3显示，阳性检出率为14%～100%。不难看出，同一地区不同牧场阳性检出率相差很大，说明牛支原体引起发病与牧场管理有直接关系。所以，做好牧场管理，把握用药剂量，调整日粮比例，对有效控制牛支原体病的发生有指导性意义。课题组从上述的406份阳性病料中共分离得到83株支原体，经纯化后鉴定的支原体共有55株。据Rifatbegovic等对荷兰奶牛呼吸道牛支原体分离结果表明，患有呼吸道疾病病牛的肺脏中牛支原体的分离率亦在20%以上。如此高的分离率说明牛支原体已经成为奶牛的常见致病微生物，牛支原体感染可能成为危害国内规模化奶牛场奶牛健康的主要疫病之一。

图1 病料中牛支原体PCR扩增结果

表3 牛支原体PCR检测结果

2.3 牛支原体感染趋势分析

如图2所示，2008～2009年和2015～2016年，调查牛场出现了较高的牛支原体感染率，阳性检出率都在70%以上，其中最高出现在2008年，阳性检出率高达84.6%；最低年份为2013年，阳性检出率为16.4%。早期发病率较高的原因，可能是国内首次发现报道的是牛支原体肺炎，因重视程度不够而导致较高的发病率。随着抗支原体药物的不断研发、引进，使得发病率逐年下降，但是滥用抗生素极易使细菌产生耐药性，近年来牛支原体检出率突然升高与之有较大的关系。在一年当中，随着季节的变化，牛群的感染率也不同，笔者对8年中每个月的阳性检出率进行了平均统计，得到的结果如图3所示。可以看出，11月到次年4月的阳性检出率较高，最高出现在3月，为70.28%。在气温较低的月份，牛机体抵抗力降低，使得牛支原体可以趁虚而入，引起疾病的发生。所以可在气温转寒之前进行药物预防和疫苗免疫，以减少牛支原体病的发生。

图2 2008～2016年牛支原体阳性检出率

图3 8年中各个月份平均阳性率

3 讨论

经对全国12个地区30个规模化奶牛场持续8年的跟踪调查表明，所有牧场均存在不同程度的牛支原体感染。课题组共检测843份血清，60份肺脏、关节液及鼻腔黏液，1 090份乳样。结果显示，血清抗体阳性率为52.31%（441/843）；病料阳性率为55%（33/60）；乳样阳性率为34.22%（373/1090）。阳性检出率如此之高，值得深思。

根据报道，欧美国家约25%～30%的牛呼吸疾病综合征是由牛支原体引起的，这与本课题组所得到的数据相近。从这些年的跟踪调查中可以看出，牛支原体肺炎、乳房炎已经发展成为流行趋势[7]。牛支原体主要的传播途径是水平传播和垂直传播[8]。水平传播包括健康牛和病牛的直接接触或经呼吸道、生殖道、乳头传播。垂直传播主要是子宫感染，在分娩过程中犊牛接触了带有牛支原体的阴道分泌液和饮用了牛支原体乳房炎患牛的初乳[9～11]。而成年牛感染另一个途径可能是人工受精，这加大了牛支原体在传播途径上的控制难度。另一方面原因是牛支原体的分离培养比较困难，笔者从1 150份样品中仅分离到55株牛支原体，污染问题和杂菌的干扰在很大程度上影响了支原体的分离培养工作。市场上尚无针对支原体的生化培养管和药敏试剂盒，支原体的培养基内又含有高比例的血清，势必会影响预期的效果。这对牛支原体疾病的初期诊断造成了很大的困扰[12～14]。

课题组在国内大部分地区采集了临床样品，通过血清学方法、病原学方法和特异性PCR方法对我国主要奶牛养殖地区牛支原体感染发病情况进行详细调查，为有效控制牛支原体病提供了流行病学数据。从样本中分离纯化55株与牛肺炎、乳房炎有关的支原体，包括产碱支原体6株、加利福尼亚支原体1株、牛生殖道支原体8株、牛支原体40株，没有分离到同样可以引起奶牛乳房炎的牛鼻支原体和加拿大支原体。由此可见，牛支原体是引起支原体病的主要支原体，并且牛支原体在国内流行比较广泛，迫切需要开展对该病的研究，为防控工作提供理论基础。

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Prevalence Investigation of Mycoplasma bovis in China

ZHANG Jian-hua1, CAO Xi-liang2, LIU Chao2, HAO Yong-qing1
(1.Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease, Ministry of Agriculture of China, College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018; 2. Bayer(Sichuan) Animal Healthcare L.td,Co; Chengdu 610225)

Mycoplasma bovis, which can lead to penumonia and mastitis of dairy cow, causes huge losses of breeding industry. Since it spreads quickly, it is very necessary to make a suitable epidemic analysis to prevent and control the spreading of this pathogens. From 2008 to 2016, we collected 483 serums, 60 lungs,synovial and Nasal mucus and 1090 milk samples from 30 large-scale dairy felds of 12 provinces. We used indirect ELISA, direct cultivation method and PCR to detect the antibody level and nucleic acid of Mycoplasma bovis. As the result shows, in the serum, positive rate is 52.31%, in pathological samples, the positive rate is close to 55%, and in milk samples, the positive rate is 34.22%.We separated 55 Mycoplasma bovis strains from these samples. As the detection result shows, Mycoplasma bovis exist in most dairy feld in China, some of them are bothering with penumonia,mastitis and arthritis. Moreover, Mycoplasma bovis has a potential to be vertical spreaded. The infection of Mycoplasma bovis may cause a huge damage in large-scale dairy felds.

Mycoplasma bovis; Cow; Epidemiological investigation

S858.23

A

1004-4264（2017）03-0023-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.03.007

2016-08-09

国家科技支撑计划资助项目(2012BAD13B00)。

张建华（1991-），男，内蒙古人，硕士研究生，研究方向为兽医微生物学与免疫学。

郝永清（1962-），男，内蒙古人，博士生导师，研究方向为兽医微生物学与免疫学。