油梨果肉DNA提取方法的比较

葛宇　林兴娥　王甲水　臧小平　马蔚红

摘 要 为了获取高质量的油梨果肉DNA，以油梨果肉为试材，比较改良SDS法、改良CTAB法和试剂盒法对油梨果肉DNA的提取效果。结果表明：上述3种方法均可从油梨果肉中提取DNA，但改良SDS法与改良CTAB法所获得的DNA浓度都在600 μg/mL以上，纯度（OD260nm/OD280nm）均在1.8左右，纯度高且完整性较好，可用于未来分子标记分析。

关键词 油梨 ；果肉 ；DNA提取 ；改良SDS法 ；改良CTAB法

中图分类号 S667.9 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.007

油梨（Persea americana Mill.）为樟科油梨属植物，又名鳄梨、牛油果，英文名为avocado。油梨起源于中美洲、墨西哥热带湿润地区及海拔较高的山地森林或热带高原，是著名的热带、亚热带果树，也是一种木本油料作物[1]。油梨于1918年被引种到中国台湾省，在海南、广东、广西、贵州、云南、台湾等地均有栽培[2-5]。油梨果实形状一般为卵圆形、倒卵圆形、圆形及梨形，重量通常为50～2 000 g[6]。油梨果肉是由果皮发育而成，富含脂肪酸、膳食纤维、蛋白质、多酚、黄酮、叶酸等多种营养物质及活性成分，其中油梨脂肪酸含量根据品种及种植条件的差异可达到其果实重量的15%～30%[7-8]。但对于DNA提取，多酚、黄酮、脂肪酸等物质会使DNA氧化成褐色凝胶状物或与DNA结合成黏稠胶状物，阻碍其作为PCR模板进行分析[9-11]。这就需要对传统的DNA提取方法加以改进，以提取出高质量的DNA。周海兰等[12]以油梨叶片为试材，对比了传统CTAB法、改良CTAB法和试剂盒法3种方法的提取效果。结果显示，通过改良CTAB法所提取的DNA的浓度和纯度要远高于通过传统CTAB法所提取的DNA。但周海兰等[12]仅对传统的CTAB法进行了改良，而未对另一种广泛应用的SDS法进行改良并分析其效果。此外，油梨果肉中所含有的影响DNA提取的物质含量，如脂肪酸、多酚、黄酮等含量，要远高于油梨叶片[6]。所以提取油梨果肉的难度要远高于油梨叶片。提取到高质量的DNA或RNA是许多分子生物学实验（PCR扩增、基因克隆、基因表达等）的初始第一步骤，而油梨作为热带水果，果肉是油梨研究的主要部位，对油梨果肉组织进行分子生物学实验将有助于深入研究油梨果肉中营养物质及活性成分的生成、代谢等[1，13]。前人已经发表了有关油梨果肉RNA提取的优化方案，但对于相对较容易的油梨果肉DNA提取优化方案未见相关报道[13]。本实验通过比较改良SDS法、改良CTAB法和试剂盒法对油梨果肉DNA的提取效果，以期获得高效的油梨果肉DNA提取方法，为后续的分子生物学实验提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用优良油梨品系‘RN-5果实样品于2016年8月在海南省儋州市中国热带农业科学院果树基地采集。每个DNA提取方法重复3次。

1.2 方法

1.2.1 改良SDS法和改良CTAB法

本实验采用的改良SDS法和改良CTAB法参照朱威龙等[14]的SDS法和CTAB法，改良之处如下：（1）在样品研磨步骤中加入0.03 g聚乙烯吡咯烷酮；（2）在SDS提取缓冲液或CTAB提取缓冲液中加入2%（m/V）的聚乙烯吡咯烷酮；（3）在温水水浴前，加入20 μL β-巯基乙醇，并于SDS提取缓冲液或CTAB提取缓冲液混匀；（4）水浴冷却后加入的提取液中加入酚，并且酚与氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1；（5）延长异丙醇沉淀时间到过夜。

1.2.2 试剂盒法

称取幼嫩叶片0.2 g，加入液氮充分研磨，使用天根生化科技（北京）有限公司生产的DNA secure plant Kit（DP320）新型植物基因組DNA提取试剂盒（离心柱型）进行提取，具体操作见产品说明书。

1.2.3 DNA质量检测

取DNA样品20 μL，用TE缓冲液稀释至10倍，用紫外分光光度计测定其OD260nm和OD280nm。DNA浓度=OD260nm×10（稀释倍数）×50（μg/mL）；DNA纯度=OD260nm/OD280nm。

取DNA样品10 μL，加入5 μL溴酚蓝缓冲液，用5%琼脂糖凝胶电泳，15 min后拍照，分析DNA的质量和完整性。

1.2.4 EST-SSR分子标记验证提取效果

以3种提取方法所获得的DNA为模板，采用油梨EST-SSR引物SHRSPa003进行PCR扩增，以检测3种DNA 提取方法的效果。油梨EST-SSR引物SHRSPa003序列信息来自Borrone等[15]的文献，油梨EST-SSR引物PCR扩增反应体系参照Ge等[16]的方法。扩增反应结束后取10 μL扩增产物进行电泳、染色、拍照分析。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法所得的DNA浓度和纯度

由表1可知，改良SDS法与改良CTAB法提取出的DNA浓度均超过600 μg/mL，浓度较高。2种方法纯度也均超过1.8，表明DNA样品中的蛋白质、酚类和脂肪酸去除较为充分，杂质较少，其DNA质量满足后续实验的要求。试剂盒法提取的DNA浓度仅为其他2种方法的十分之一，DNA纯度也较比其他2种方法低近1倍，其DNA质量很难满足后续实验的要求。

2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳

由图1可知，改良SDS法、改良CTAB法和试剂盒法3种方法均能从油梨果肉中提取出DNA，其大小均在2.0 kb以上。改良SDS法与改良CTAB法提取的DNA量明显高于试剂盒法，其电泳条带也明显比试剂盒法的亮，提取效果的稳定性好。但改良SDS法提取DNA的3次重复所得的效果并不相同，有些DNA条带较亮，有些较暗，重复性较比改良CTAB法较差。

2.3 EST-SSR標记PCR扩增验证

由图2可知，改良SDS法与改良CTAB法提取的DNA模板均可扩增出比较清晰的EST-SSR标记条带，且稳定性好；试剂盒法提取的DNA未成功扩增出清晰的EST-SSR标记条带，这可能是含有较多的蛋白质、糖、色素等反应抑制物所导致的。综上所述，改良SDS法与改良CTAB法提取的油梨果肉DNA纯度高，杂质去除充分，可满足EST-SSR等分子标记分析的需要。

3 讨论与结论

3.1 讨论

利用紫外分光光度法测定DNA纯度时，如果1.9>OD260nm/OD280nm>1.8时，表明DNA样品受杂质污染少，质量高；如果OD260nm/OD280nm>1.9时，表明DNA样品存在少量RNA；如果OD260nm/OD280nm<1.8时，表明DNA样品存在蛋白质等杂质[17]。由于油梨果肉含有大量脂肪酸，利用试剂盒法提取过程中脂肪酸等物质很容易形成粘稠的胶状物质，难于溶解堵塞柱子造成所获得的DNA浓度低，质量不高。

与寒温带水果相比，热带水果叶片、果实等各部位普遍含有更多的多糖、多酚、蛋白质等物质，其中果实内各种物质又比其它部位更多，这些物质对DNA的提取影响较大[11，18-19]。前人对热带水果DNA的提取，把聚乙烯吡咯烷酮和β-巯基乙醇加入到传统的SDS法和CTAB法中，大幅提高了DNA的浓度与质量，取得了较好的结果[10-12，20-23]。本实验中的改良SDS法和改良CTAB法，在前处理期加入了聚乙烯吡咯烷酮，其可有效防止多酚氧化，并可与酚类、单宁酸、脂肪酸等共沉淀用以去除杂质。在裂解液中加入了聚乙烯吡咯烷酮和β-巯基乙醇，可进一步抑制多酚氧化，并去除杂质。此外，延长异丙醇沉淀时间到过夜。前人研究结果表明，异丙醇沉淀时间越长，DNA浓度越高[24]。本实验改良CTAB法与周海兰等[12]的改良CTAB法略有区别，本实验额外增加了2个步骤，即水浴冷却后加入的提取液中加入了酚和延长异丙醇沉淀时间到过夜。这2个步骤前一个可更有效地抽提DNA，而第2个步骤可提高DNA浓度。虽然油梨果肉的杂质或抑制物质比叶片多，但本实验改良CTAB法增加的2个步骤使得提取的DNA纯度（1.81）与周海兰等[12]的通过改良CTAB法提取的DNA纯度（1.7～2.0）大致相同。

3.2 结论

本实验采取改良SDS法、改良CTAB法和试剂盒法3种DNA提取方案从油梨果实中提取DNA，通过比较DNA的浓度和纯度，进一步通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和纯度，确定了提取DNA质量较高的方法为改良SDS法和改良CTAB法。

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