右美托咪定对乳大鼠心肌细胞线粒体活性氧和细胞凋亡的影响*

曹露 周丹 李涛 陈琳琳 谭晓秋 刘力 刘雪茹△

(1.西南医科大学附属医院麻醉科； 2.医学电生理学教育部重点实验室·西南医科大学心血管医学研究所，四川 泸州 646000)

论 著

右美托咪定对乳大鼠心肌细胞线粒体活性氧和细胞凋亡的影响*

曹露1周丹1李涛2陈琳琳2谭晓秋2刘力1刘雪茹1△

(1.西南医科大学附属医院麻醉科； 2.医学电生理学教育部重点实验室·西南医科大学心血管医学研究所，四川 泸州 646000)

目的：探讨右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)对线粒体介导的乳大鼠心肌细胞氧化应激通路的作用。方法：取新生乳大鼠(3～4天)的心肌进行原代培养，培养24 h后分为对照组(C组)、H2O2组(终浓度500 μM，H组)、右美托咪定组(5 μM DEX，D组)、联合用药组(500 μM H2O2+5 μM DEX，DH组)。各组细胞分别给予相应药物刺激6 h，采用流式细胞仪测定活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)水平及心肌细胞凋亡变化；并通过ELISA法测定各组乳大鼠心肌细胞线粒体介导的凋亡因子Caspase-3，Caspase-9表达的变化。结果：与H2O2组相比，DEX明显抑制H2O2介导的乳大鼠心肌细胞的ROS水平增加(P<0.05)；下调线粒体介导的下游凋亡因子Caspase-3, Caspase-9的表达(P<0.05)，从而减少H2O2诱导的凋亡(P<0.05)。结论：右美托咪定通过抑制心肌细胞活性氧水平以及下调线粒体介导的Caspase-3和Caspase-9的表达发挥抑制凋亡作用，对心肌细胞有一定的保护作用。

右美托咪定；心肌细胞；活性氧；氧化应激；细胞凋亡

右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)是一种新型的高选择性的α2肾上腺素受体激动剂，目前广泛应用于ICU和手术过程中[1,2]。可通过抑制交感神经兴奋性和增强迷走神经兴奋性，产生镇静、镇痛、抗焦虑、抗惊厥、抗寒颤、催眠遗忘、稳定血流动力学、减少插管时应激反应、减少麻醉剂与阿片类药物的用量和改善麻醉恢复等一系列作用[3]。右美托咪定对机体许多重要脏器如心脏、大脑、肾脏、肝、肺、胃肠道等具有保护作用[4,5]。有研究报道提示，DEX减少心肌I/R损伤可能与调控心肌线粒体渗透性转换孔(Mitochondrial permeability transition pore, mPTP)开放及其上游线粒体ATP敏感性钾通道(Mitochondrial ATP sensitive potassium channels, mitoKATP)活性有关[6]。由于线粒体氧化应激在心肌损伤与保护中发挥重要作用，而活性氧(Rreactive oxygen species，ROS)在一定程度上能够反应细胞氧化应激程度。本文拟探讨右美托咪定对线粒体介导的乳大鼠心肌细胞氧化应激通路的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

新生SD大鼠3～4天(由西南医科大学动物实验中心提供)；右美托咪定(江苏恩华)；H2O2(Sigma，美国)；DMEM培养液和胎牛血清(Gibco，美国)；0.25%胰蛋白酶(Sigma，美国)；罗丹明标记鬼笔环肽(Rhodamine Phalloidin)(Cytoskeleton，美国)；DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)、活性氧检测试剂盒、Caspase-3和Caspase-9试剂盒(碧云天，中国)。

1.2 乳鼠心肌细胞培养

首先将新生乳鼠心脏在无菌条件下取出，经PBS液反复冲洗后，剪去心房和结缔组织，然后再用PBS液冲洗，剪成1 mm3碎块，再加入0.25%胰蛋白酶置于4℃冰箱过夜，Ⅱ型胶原酶洗涤2次，直到心脏组织基本消化完毕，1500 g·min-1离心5min后去除上清液，再用含10%FBS的DMEM培养基将沉淀充分吹打混匀，在37℃、5%CO2培养箱中通过差速贴壁，以去除心脏的成纤维细胞和内皮细胞，再次的心肌细胞悬液取8 ml接种到4个3.5 cm的培养皿中并置于37℃、5%CO2的培养箱中，培养48 h后分组处理。

1.3 实验分组

实验分为四组：对照组(C组)、H2O2组(H组)、右美托咪定组(D组)、右美托咪定+H2O2组(DH组)。首先对D组和DH组加入终浓度为0.5 μM的右美托咪定，随后置于37℃细胞培养箱12 h孵育。待孵育结束后，在H组和DH组中加入500 μM的H2O2进行孵育。

1.4 流式细胞术检测活性氧自由基(ROS)水平变化

由于乳鼠心肌细胞是贴壁细胞，采用原位装载探针检测ROS的方法。使用1:1000无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10 μM。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。各组心肌细胞于37℃下避光孵育0.5 h，再用PBS洗两次，然后用流式细胞仪检测。同时设置阳性对照(Rosup)，通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30 min后可以显著提高活性氧水平。

1.5 ELISA法检测Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达

Caspase-3，Caspase-9检测方法按照试剂盒(江苏碧云天公司)说明书进行，主要包括测定pNA标准曲线、样品收集、酶活性的检测等实验步骤。以对照组(未经DEX和H2O2处理)的pNA的量为1，对其他三组的pNA的量进行标准化，从而比较各组Caspase-3，Caspase-9的活性。

1.6 细胞免疫荧光实验

采用FITC标记α-肌动蛋白观察培养的心肌细胞的形态。将培养的心肌细胞铺在玻片上生长，48 h后取出，PBS清洗三遍后分别用4%的多聚甲醛室温固定20 min，0.1%的Triton X-100处理20 min，5%的BSA室温封闭1 h，之后使用小鼠抗α-肌动蛋白一抗4℃孵育过夜，FITC标记的抗小鼠二抗孵育1 h，最后使用DAPI室温孵育10 min后进行封片，在荧光显微镜下进行观察。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

采用流式细胞术测定细胞凋亡。培养的心肌细胞经过上述处理之后，使用胰酶消化为单个的心肌细胞，按照试剂盒说明书进行染色后使用流式细胞仪(BD公司)进行检测细胞凋亡情况。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 心肌细胞形态学

使用FITC标记α-肌动蛋白观察心肌细胞形态，结果如图1所示。培养的心肌细胞呈梭形，横纹和肌动蛋白清晰。

图1 乳鼠心肌细胞形态(600X)蓝色：DAPI染的细胞核；绿色：FITC标记的α-actin。

2.2 DEX对H2O2诱导的心肌细胞ROS的影响

与对照组相比，阳性处理组(Rosup)的ROS水平明显增加(P<0.01)。500 μM H2O2处理6 h后，ROS水平也明显增加(P<0.05)。联合使用500 μM H2O2和5 μM DEX，与单纯使用H2O2组相比，ROS水平明显下降(P<0.05)。而单独使用5 μM DEX，ROS水平的下降并无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 DEX对H2O2诱导的心肌细胞ROS的影响(n=5)注：与Control相比，*P<0.05；与500 μM H2O2组相比，#P<0.05。

2.3 DEX对H2O2诱导的心肌细胞Caspase-3、Caspase-9表达的影响

与对照组相比，500 μM H2O2处理6 h后，Caspase-3和Caspase-9表达明显增加(P<0.01)。联合使用500 μM H2O2和5 μM DEX，与单纯使用H2O2组相比，Caspase-3和Caspase-9表达明显增加(P<0.05)。与对照组相比，联合使用的H2O2和DEX的Caspase-3和Caspase-9表达依然有所增加(P<0.05)。而单独使用5 μM DEX，Caspase-3和Caspase-9表达水平有所降低，但并没有统计学意义(P>0.05)。

图3 DEX对H2O2诱导的心肌细胞Caspase-3、-9活性的影响(n=4)注：与Control相比，*P<0.05，**P<0.05；与500 μM H2O2组相比，#P<0.05。

2.4 DEX对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的影响

从图4中可以看出，对照组细胞仅有19.9%的细胞凋亡率(第一象限和第四象限之和)，而使用H2O2处理之后，细胞凋亡率明显增加，由19.9%增加到65.7%(其中早期凋亡占46.2%，晚期凋亡占19.5%)。在使用H2O2的同时加入右美托咪定，可以明显降低细胞凋亡率，细胞凋亡率为38.0%(其中早期凋亡占24.9%，晚期凋亡占13.1%)。

图4 流式细胞术检测DEX对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的影响注：Negative为没有使用凋亡检测试剂的阴性对照，用于细胞形态和荧光校正与调零。

3 讨论

右美托咪定(DEX)因具有镇静，镇痛，抗交感而无呼吸抑制的临床特点而在临床上广泛使用。有研究表明DEX还具有心肌保护作用，包括能够降低心输出量、前后负荷，减慢心率，降低心肌耗氧量，增加心内膜的血液供应，使心肌氧供需趋于平衡[7]。但是也有研究提示右美托咪定不但对血流动力学和冠状动脉血流量没有影响，反而增加心肌梗塞面积[8]。表明右美托咪定对心肌保护的作用机制还需进一步研究。

线粒体是真核动物细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所，被称为细胞的“动力工厂”。线粒体生物氧化和能量转换的过程中伴随着活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生[9]。ROS是参与维持细胞正常生理功能[10]，以及组织修复等活动，而当ROS将过度生成，超过了抗氧化的能力，增加了心肌氧化的应激反应,进而对线粒体的功能和能量的产生造成了不可逆的损伤，最终导致心肌细胞凋亡[11]。因此可知线粒体氧化应激将导致线粒体能量代谢失调，从而进一步损伤了线粒体[12]。心肌细胞的凋亡是心肌损伤的重要机制，而线粒体凋亡途径在心肌细胞的凋亡起着非常重要的作用[13]。Caspase-3、Caspase-9活性和表达增加被认为是线粒体凋亡途径发生的标志[14]。有关通路在DEX心肌细胞保护中的作用的研究未见系统的报道。

过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激模型是常用于研究心肌细胞氧化应激损伤的手段之一，本实验研究了DEX对H2O2诱导的氧化应激损伤后ROS和细胞凋亡的影响。实验结果表明，H2O2明显增加心肌细胞ROS水平，使线粒体介导的细胞凋亡分子Caspase-3、Caspase-9表达增加，导致心肌细胞凋亡。而DEX能够一定程度逆转了H2O2导致的氧化应激损伤。结果表明DEX能够作用于心肌细胞的线粒体凋亡通路，抑制H2O2对心肌细胞的损伤，降低了心肌细胞凋亡。实验结果表明,单给DEX组的ROS产生与正常组相比不存在差异，这说DEX并未对基础水平的ROS产生影响。而H2O2则会引起心肌细胞ROS产量增加，造成过量的ROS得不到有效的清除。因此过量的ROS能够造成线粒体氧化还原状态失衡，引起线粒体凋亡通路活化，并导致细胞凋亡。而DEX能够缓解治疗组心肌细胞的氧化应激负荷，抑制细胞内ROS产生，减少Caspase-3、Caspase-9的表达活性。

综上所述，DEX能够抑制心肌细胞的线粒体凋亡途径，达到保护心肌细胞的作用，但是其具体的信号转导机制还需进一步的深入研究。

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Effects of dexmedetomidine on ROS and apoptosis in neonatal rat cardiac muscle cells*

Cao Lu1, Zhou Dan1, Li Tao2, Chen Lin-lin1, Tan Xiao-qiu1, Liu Li1, Liu Xue-ru1△

(1.Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Southwest Medical University; 2. Key Lab of Medical Electrophysiology, Ministry of Education; Institute of Cardiovascular Medicine, Southwest Medical University, Sichuan Luzhou 646000)

Objective：To investigate the effects of dexmedetomidine (DEX) on ROS and apoptosis in neonatal rat cardiac muscle cells. Methods: Neonatal rats (3-4 days) cardiomyocytes (NRCMs) were cultured for 24 h and divided into four groups: control group (Group C), H2O2group (final concentration of 500 μM, Group H), dexmedetomidine group (5 μM DEX, group D), and H2O2+DEX group (500 μM H2O2+ 5 μM DEX, group DH). Flow cytometry (FCM) was used to measure the effect of DEX on the ROS level and apoptosis of myocardial cells in rats. The level of Caspase-3 and Caspase-9 were detected by ELISA. Results: DEX significantly inhibited the increase of ROS levels in NRCMs induced by H2O2(P<0.05). The increased level of Caspase-3, Caspase-9 induced by H2O2was significantly inhibited by DEX (P<0.01 or P<0.05). DEX significantly attenuated cells ratio of apoptosis induced by H2O2(P<0.05). Conclusion: Dexmedetomidine inhibited the ROS levels and the activity of mitochondria mediated Caspase-3 and Caspase-9 expression and attenuated H2O2-induced apoptosis in myocardial cells, which may involved in the myocardial protective effect of DEX.

Dexmedetomidine; Myocardial cells; ROS; Oxidative stress; Apoptosis

国家自然科学基金资助项目(编号：81401632)；西南医科大学青年基金项目(编号：2014QN-003)

曹露，女，硕士研究生在读，主要从事临床麻醉学研究，Email：85933718@qq.com。

△通讯作者：刘雪茹，女，讲师，主要从事临床麻醉学研究，Email：liuxueru1981@163.com。

2016-11-28)