核桃肽对幼年小鼠学习记忆能力的影响

杜倩 乌兰 刘睿 樊蕊 陈启贺 任金威 李勇

婴幼儿时期是人类生长发育的黄金时期，而神经系统的发育主要集中在这一时期，大脑的重量可发育达到成人期的75%，3周岁时脑发育基本完成[1-2]。神经系统的发育不仅影响着婴幼儿生理和心理的整体发展，还影响着成年后的智力水平和身心健康。因此，对促进幼年时期神经发育的功能物质的探索与研究成为热点。

核桃(juglans regia L.)，又名胡桃，在我国广泛栽培，年产量居世界首位[3]。核桃富含不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素及矿物质，其蛋白质中含有的氨基酸构成合理，具有极高的营养价值。核桃肽(walnut peptides，WP)是通过生物酶解技术从核桃中获得具有显著活性的小分子物质，不经消化即可被人体吸收，吸收效率比单一氨基酸更高[4]。核桃及其加工产品因其促进认知及学习记忆能力的功效，被奉为传统的补脑佳品。目前实验证明，核桃饲养可提高发育期小鼠的脑发育，增强其学习记忆能力[5]。也有研究证实从核桃中提取的以瓜氨酸为主要成分的多种氨基酸混合物对小鼠的学习记忆能力有改善作用[6]。但对于生物效价极高的WP对幼年小鼠学习记忆的影响尚无研究报道，因此，本实验对幼年小鼠采用不同剂量的WP进行干预，探讨WP对学习记忆功能的影响，为WP在婴幼儿功能食品中的应用提供实验依据。

材料和方法

一、材料

1.核桃肽(WP)：淡黄色固体粉末，主要成分为分子量小于1 000的小分子低聚肽，其中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸含量较多，由北京天肽生物科技有限公司提供。

2.实验动物：初断乳SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体重10～12 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供(实验动物生产许可证号：SCXK(京)2011-0012)，于屏障级动物室饲养，温度范围(22±2)℃，相对湿度50%～60%，昼∶夜=12h∶12h。

3.主要仪器：Morris水迷宫系统(中国医学科学院药物研究所)，小鼠电刺激跳台仪(中国科学院上海药物研究所)，程控小鼠穿梭箱(中国医学科学院药物研究所)。

二、方法

1.动物分组和饲养：小鼠适应性喂养1周，按照体重随机分为4组，空白对照组给予普通饮水，WP干预组分别给予低、中、高浓度WP(浓度依次为110 mg/kg·bw、220 mg/kg·bw和440 mg/kg·bw)，均随饮水摄入。所有动物均自由饮水进食，并记录每日饮水量、进食量及体重增长，干预30 d后进行行为学实验。

2.开阔场实验(Open-field Test)：采用木制箱，规格为45 cm×45 cm×45 cm，内衬黑色垫纸，底部为白色，并画有5×5正方格。实验时将小鼠轻轻放入中央格中，记录5 min内小鼠的跨格次数、站立次数、进入中央格的次数、中央格停留时间和外周格停留时间等。

3. Morris水迷宫实验(Morris Water Maze)：实验时将平台置于第一象限中央，加水至高于平台1～1.5 cm，水温保持在(21±1)℃，为避免小鼠看到平台，在水中加入二氧化钛。整个实验过程分为定位航行实验(place navigation test)和空间探索实验(spatial probe test)两部分。

(1)定位航行实验：用于测量小鼠在水迷宫中的学习和记忆能力，实验历时6 d。测试时，每天小鼠分别从东、西、南、北4个象限面向池壁轻轻放入水中，每次测试间隔5 min，记录小鼠从入水到找到平台所需的时间(逃避潜伏期)、游泳路程和游泳速度，4次成绩的平均值作为当日最终成绩进入最后统计分析。如果小鼠在60 s内未找到平台，则由实验者将其引导至平台并在平台上停留10 s，逃避潜伏期记为60 s。

(2)空间探索实验：用于测量小鼠对平台空间位置的记忆保持能力，第7天撤去平台，将小鼠从第三象限的任选一点放入水中，记录60 s内小鼠在目标象限(定位航行实验中平台所在象限)的停留时间及准确穿越平台所在位置的次数。

4.跳台实验(Step-down Test)：跳台测试仪有5个测试室，室底铜栅可通电，每个测试室右后角放置一个高5 cm、直径5 cm的橡皮平台作为动物回避电击的安全区。实验时先将小鼠放入反应箱内(平台上、平台下)适应环境3 min，然后将其放在铜栅上，通以32 V的交流电，观察小鼠受到电击跳回平台以及再次跳至铜栅上的情况。如此训练5 min，记录每只小鼠受电击的次数或称错误次数(EN1)，以此作为学习成绩。24 h后进行重复测验，将小鼠置于平台上，记录各鼠第一次跳下平台的时间，即停留潜伏期(step-down latency，SDL)和各鼠5min内的错误次数(EN2)，以此作为记忆成绩。若5 min内小鼠未跳下平台，潜伏期按5 min计算。停止实验5 d后再进行一次重复实验，记录上述指标，作为记忆消退阶段的成绩。

5.穿梭箱实验(Shuttle Test)：实验时将小鼠放入穿梭箱内任何一侧适应3 min，进行10 s声光刺激，如动物不逃至另一端，声光刺激后给予电刺激(0.2 mA，50 Hz，AC)，持续10 s，小鼠在遭电击后即跑到对侧，此为被动回避反应(passive avoidance reaction，PAR)。在每次电击前给予条件刺激，反复强化后，声音刺激后小鼠即能完成穿梭动作为主动回避反应(active avoidance reaction，AAR)，不能逃避的即为失败(fail)。连续训练4 d，每天10次，每次间隔15 s。记录主动回避次数及被动回避次数。

6.抗氧化性检测：行为学检测结束后，摘除小鼠眼球采血，3 000 rpm/10 min分离血清。测定血清中总的超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase，T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量。

7.统计学处理：应用SPSS统计软件进行分析，实验结果采用均数±标准差表示。水迷宫实验逃避潜伏期、穿梭箱实验主动回避与电击次数采用重复测量方差分析(one-way repeated measures ANOVA)，其他数据如果具有方差齐性，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)；若方差不齐，采用非参数检验；两组间比较采用最小显著差异法(LSD)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、WP对小鼠饮水量、进食量、体重、脑重的影响

在实验干预过程中，各组小鼠的饮水量、进食量组间差异无统计学意义。各组小鼠干预前体重、干预结束后体重、脑重和脑体比差异均无统计学意义，见表1。

二、开阔场实验

在开阔场实验中，各组小鼠站立次数和跨格次数、进入中央格次数及停留时间差异均无统计学意义，见表2。

表1 WP对幼鼠饮水量、进食量、体重、脑重和脑体比的影响

表2 WP对幼鼠自主活动能力和情绪反应的影响

三、Morris水迷宫实验

定位航行实验结果见图1，随着时间的延长，各组小鼠的逃避潜伏期均表现出降低的趋势(F=11.128，P<0.001)；不同组别的逃避潜伏期差异有统计学意义(F=3.018，P=0.025)，WP高剂量组逃避潜伏期较空白对照组短，差异有统计学意义。

空间探索实验如表3所示，第7天小鼠在目标象限的停留时间差异有统计学意义(F=2.708，P=0.039)，WP中剂量组小鼠的目标象限停留时间高于空白对照组；各组小鼠的穿台次数差异有统计学意义(χ2=11.298，P=0.023)，与空白对照组相比，WP中、高剂量组小鼠的穿台次数增加。

图1 各组小鼠逃避潜伏期随时间的变化趋势

组别目标象限停留时间(s)穿台次数空白对照组18 08±12 371 30±1 50WP低剂量组20 60±8 461 60±1 80WP中剂量组32 36±13 53∗3 70±3 30∗WP高剂量组27 16±11 184 80±3 60∗

注：与空白对照组比较，*P<0.05

四、跳台实验

跳台实验结果如图2所示，在24 h测试时，各组小鼠错误次数差异有统计学意义(F=2.870，P=0.031)，WP低、高剂量组错误次数低于空白对照组；各组停留潜伏期差异有统计学意义(F=4.952，P=0.002)，与空白对照组相比，三个干预组停留潜伏期均较长。实验结束5 d后重复测试，各组小鼠错误次数(χ2=14.05，P=0.007)和停留潜伏期(χ2=15.071，P=0.005)差异均有统计学意义，其中WP中剂量组的错误次数比空白对照组少，同时停留潜伏期较长。

注：与空白对照组比较，*P<0.05图2 WP对幼鼠跳台实验的影响

五、穿梭箱实验

穿梭箱实验结果如图3所示，随着时间的延长，各组小鼠的主动逃避次数均逐渐增加(F=24.647，P<0.001)，各组的电击次数同样逐渐减少(F=14.570，P<0.001)；不同组别主动回避次数(F=4.886，P=0.002)和电击次数(F=4.641，P=0.003)差异有统计学意义，三个干预组组小鼠的主动回避次数高于空白对照组，电击次数低于空白对照组，组间差异有统计学意义。

图3 各组小鼠的主动回避次数和电击次数的变化趋势

六、抗氧化性检测

对小鼠血清抗氧化指标分析结果显示，WP低、中、高剂量组血清T-SOD与GSH-Px活性相比空白对照组升高，差异有统计学意义。对小鼠血清中氧化产物分析结果显示，WP低、中、高剂量组血清丙二醛浓度均低于空白对照组，差异有统计学意义，见表4。

表4 WP对幼鼠血清抗氧化指标的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05

讨 论

婴幼儿时期的脑发育基本完成，因此，促进脑部发育，改善幼年学习记忆的发生发展十分重要，许多对学习记忆有促进功能的食品成为研究热点。

核桃自古被中医奉为健脑佳品，近年来才有研究证实核桃具有改善学习记忆的功效。张清安等针对核桃中健脑的功能成分展开研究，证实核桃油中的多不饱和脂肪酸有显著的益脑功效[7]。大量研究证实多不饱和脂肪酸如α-亚麻酸、二十二碳六烯酸(DHA)等可以促进神经发育、改善学习记忆[8-10]。同时樊永波等[11]对脱脂的核桃饼粕进行研究，对其学习记忆的促进作用也得到肯定的结果，发现精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸含量较高的核桃蛋白也是增强学习记忆功能的有效成分。研究表明，谷氨酸、天冬氨酸是哺乳动物体内不可缺少的兴奋性神经递质，与学习和记忆的形成密切相关[12-13]。

Morris水迷宫定位航行实验用于测量小鼠在水迷宫中的学习和记忆能力，空间探索实验用于测量小鼠对平台空间位置的记忆保持能力。本研究中，消除由于小鼠自主活动能力和情绪反应不同而影响行为学实验结果的可能，WP的干预可使小鼠的逃避潜伏期低于空白对照组，而WP中、高剂量组目标象限停留时间、穿台次数均增加，以上结果可以说明WP干预幼年小鼠可以增强小鼠学习和空间记忆能力，同时，也可以延缓小鼠空间记忆的衰退，干预效果有一定的剂量反应关系。跳台实验中，小鼠受到电击，应逐渐学会跳回平台以避免伤害性刺激。训练后24 h测试WP低、高剂量组错误次数降低、停留潜伏期延长，5 d后再次测试，WP中剂量组对电击的记忆消退较慢。穿梭箱实验过程中，随着时间的推移，各组小鼠的逃避反应增加，证明学习效果在不断增强；与空白对照组相比，三个剂量的WP干预后，小鼠的主动回避次数增多，受到电击次数减少，有一定的剂量反应关系，提示WP的干预增强了小鼠对电刺激的记忆。以上行为学实验结果均为阳性，证明WP可以提升小鼠的空间学习记忆能力、主动和被动回避能力，这与对核桃及其提取物的研究结果相同[5-6]。

脑组织中的主要成分之一不饱和脂肪酸含量丰富，极易受到脂质过氧化的损伤，影响脑发育和脑功能[14]。SOD与GSH-Px都可催化体内清除自由基过程，保护细胞膜正常功能进行，而MDA是脂质过氧化的最终产物。本研究血清抗氧化性测定显示，WP的干预使抗氧化物质T-SOD及GSH-Px与空白对照组相比活性升高，同时氧化产物MDA水平降低，表明WP可显著提高组织抗氧化性，增强清除氧自由基的能力，进而推断WP可能通过减少不饱和脂肪酸的氧化损伤，促进脑发育，提高学习记忆能力，但其分子机制需要进一步证实。林海生等研究发现，体内抗氧化指标与学习记忆行为学指标存在着紧密的相关性，提示牡蛎蛋白肽可能通过其抗氧化活性而改善学习记忆功能[15]。

目前，许多研究提示一些生物活性肽具有改善学习记忆的功能，林海生等[15]发现牡蛎蛋白肽能够增强正常小鼠的空间学习和记忆能力；裴新荣等[16]发现海洋胶原肽可预防快速老化小鼠学习记忆功能的下降；徐琳琳等[17]进行一系列行为学实验发现乳源性活性肽能够改善学习记忆能力。本研究中WP有类似的功能，能够促进幼年小鼠的学习记忆能力。该研究结果为婴幼儿奶粉中添加WP或开发WP婴幼儿食品、辅食提供实验依据。WP影响学习记忆能力的机制，可能与其抗氧化性有关，还可能存在其他机制，均有待进一步研究。

1 季成叶.儿童少年卫生学.第7版.北京:人民卫生出版社,2012.

2 桂永浩，薛辛东.儿科学.第3版.北京:人民卫生出版社,2015.

3 邓金龙.我国核桃生产现状及发展策略.林产工业,2016,43:56-58.

4 李勇，蔡木易.肽营养学.北京:北京大学医学出版社,2007.

5 虞立霞，姚奎章，夏君霞，等.核桃对发育期小鼠认知功能的改善作用.营养学报,2015,37:185-188.

6 赵海峰，李学敏，肖荣.核桃提取物对改善小鼠学习和记忆作用的实验研究.山西医科大学学报,2004，35:20-22.

7 张清安，李建科，范学辉.核桃油对小鼠学习记忆能力的影响.陕西师范大学学报(自然科学版),2006，34:89-91.

8 田枫，齐晓旭，郑振辉.α-亚麻酸对大鼠学习记忆功能和海马神经元的影响.中国老年学杂志,2009，29:664-666.

9 Zicker SC,Jewell DE,Yamka RM,et al.Evaluation of cognitive learning,memory,psychomotor,immunologic,and retinal functions in healthy puppies fed foods fortified with docosahexaenoic acid-rich fish oil from 8 to 52 weeks of age.J Am Vet Med Assoc,2012,241:583-594.

10 李红娟，刘德华.发育期补充DHA对大鼠学习记忆的影响.中国公共卫生,2001，17:32-33.

11 樊永波，陶兴无，马琳，等.核桃饼粕对大鼠学习、记忆和抗氧化功能的影响.食品科学,2013，34:323-326.

12 Kant D,Tripathi S,Qureshi MF,et al.The effect of glial glutamine synthetase inhibition on recognition and temporal memories in the rat.Neurosci Lett,2014,560:98-102.

13 Topo E,Soricelli A,Di Maio A,et al.Evidence for the involvement of d-aspartic acid in learning and memory of rat.Amino Acids,2010,38:1561-1569.

14 曹锡清.脂质过氧化对细胞与机体的作用.生物化学与生物物理进展,1986,2:17-23.

15 林海生，曹文红，卢虹玉，等.牡蛎蛋白酶解物改善小鼠学习记忆能力及其体内抗氧化活性的研究.食品科技,2013，38:37-41.

16 裴新荣，杨睿悦，赵海峰，等.海洋胶原肽预防SAMP8小鼠学习记忆功能下降的实验研究.食品与发酵工业,2009，35:1-5.

17 徐琳琳，马奕，许雅君，等.乳清蛋白肽改善C57BL/6J小鼠学习记忆功能研究.现代预防医学,2011，38:1090-1092.