无精子症患者单精子卵胞浆内注射临床结局的男方相关因素分析

左阳花 仲纪祥 邱峰龙 冯播 薛惠英 张继跃

单精子卵胞浆内注射(introcytoplasmic sperm injection,ICSI)是把一条可用精子制动后直接注射到卵母细胞的胞浆内使卵母细胞受精的技术，无精子症是ICSI的绝对适应症。1994年Devroey等[1]首次报道睾丸手术取精成功用于ICSI，这项技术的成功使得梗阻性和部分非梗阻性的无精子症患者有获得自己生物学后代的可能。自从睾丸穿刺(TESE)的精子成功用于ICSI以来，学者们一直在探索影响ICSI临床结局的可能因素。本文主要是评价男方年龄、发病原因(梗阻性无精子症或非梗阻性无精子症)以及精子来源(新鲜或冷冻)等因素对ICSI临床结局的影响。

对象与方法

1.对象：回顾分析2012年12月至2015年12月在本生殖中心107例行ICSI的无精子症患者，入组条件为(1)女方年龄28～35岁；(2)男方无精子症但TESE能找到可用精子。排除标准为女方因素不孕。如子宫畸形、中重度子宫内膜异位症、输卵管积水等。共计纳入107例患者，根据男方年龄分为A组(<30岁)、B组(30≤～≤40岁)和C组(>40岁)；根据病因分为梗阻性无精子症(OA)组和非梗阻性(NOA)组；根据精子来源分为新鲜组和冷冻组；分别分析影响ICSI结局的相关因素。本研究经过本院伦理委员会通过，且所有研究均知情同意。

2.促排卵治疗：采用本中心常规促排方案进行促排卵治疗，B超监测卵泡，当1～2个卵泡直径≥18 mm，或3个以上卵泡直径≥17 mm或4个以上卵泡直径≥16 mm，当天晚上肌注hCG10 000 U(丽珠制药)或者重组人绒促性素注射液(德国默克雪兰诺，批准文号：S201230091，规格型号：250 μg)1支，36 h后取卵。

3.精子处理：(1)新鲜穿刺的睾丸精子。将所取睾丸曲细精管置培养皿中用G-IVF(Vitrolife,瑞典)洗涤2次，用2个1 ml无菌注射器(需将其针头折平)相互碾碎组织，静置后于倒置显微镜下观察并纪录结果。将组织碎片和洗涤液一起300 g离心10 min。去上清，用1 ml G-IVF液体混匀沉淀，装于5 ml小试管中，置于室温下备用，用之前30 min于培养箱中复温。(2)冷冻睾丸精子处理。将冻存管置于37℃水浴箱10 min，融解后用培养液稀释，经离心洗涤去除冷冻保护剂，然后将沉淀悬浮于小滴培养液中，即可用于ICSI。

4.ICSI操作：取卵后培养4 h，在体视镜下先将卵子放入80 U/ml的Hyluronidase(SAGE，美国)消化酶中，不断轻轻吹吸，作用30 s后，用不同口径的用巴氏吸管吹吸，脱除颗粒细胞后将其转移到G-1(Vitrolife，瑞典)中培养1 h，行ICSI。

5.胚胎观察和胚胎移植：ICSI后卵子置于覆盖油的G-1(Vitrolife,瑞典)微滴中培养，16～18 h后观察受精情况，44 h和68 h看胚胎分裂情况，并选择可用胚胎进行移植。

6.统计学处理：应用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计数资料采用百分率表示，计量资料采用均数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。其中，胚胎种植率=种植胚胎总数/移植胚胎总数×100%；临床妊娠率=妊娠总人数/移植总人数×100%；活产率=分娩活婴(双、多胎按1个计算)/移植周期数×100%；流产率=(早期流产数+晚期流产数)/临床妊娠数×100%。

结果

1.不同年龄组患者ICSI临床结局比较：男方年龄<30岁组的女方年龄为(29.8±1.8)岁，基础FSH(7.4±1.8)U/L，BMI指数(22.7±3.5)kg/m2，内膜厚度(11.4±1.7)mm，成熟卵数(9.9±2.4)个；30≤男方年龄≤40岁组女方年龄为(30.4±2.5)岁，基础FSH(7.3±1.9) U/L，BMI指数(22.3±3.2)kg/m2，内膜厚度(11.2±1.8)mm，成熟卵数(9.2±2.1)个；男方年龄>40岁组女方年龄为(32.4±2.8)岁，基础FSH (7.0±1.7)U/L，BMI指数(23.2±3.3)kg/m2，内膜厚度(11.0±2.6)mm，成熟卵数(8.4±2.2)个，三组的女方年龄、基础FSH、BMI指数、内膜厚度以及成熟卵数比较差异均无统计学意义。不同年龄组患者正常受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率、临床妊娠率、活产率、流产率比较差异也均无统计学意义。见表1。

表1 男方年龄与临床ICSI结局的关系

临床妊娠妊娠总人数移植总人数临床妊娠率(%)活产分娩活婴数移植周期数活产率(%)流产流产数临床妊娠数流产率(%)193063 3173056 621910 5213560 0183551 42219 5264261 9224252 332611 5

2.不同病因组ICSI临床结局比较：NOA组患者女方年龄(30.8±2.1)岁，基础FSH (7.2±1.9)U/L，BMI指数(22.5±3.2)kg/m2，内膜厚度(11.1±1.9)mm，成熟卵数(9.2±2.3)个；OA组患者女方年龄(31.2±2.3)岁，基础FSH (7.3±2.1)U/L，BMI指数(22.7±3.4)kg/m2，内膜厚度(11.3±1.9)mm，成熟卵数(9.3±2.4)个。两组患者女方年龄、基础FSH、BMI指数、内膜厚度以及成熟卵数数据比较，差异无统计学意义。NOA组和OA组患者正常受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率、临床妊娠率、活产率、流产率数据比较，差异无统计学意义。见表2。

表2 不同病因组临床结局比较

临床妊娠妊娠总人数移植总人数临床妊娠率(%)活产分娩活婴数移植周期数活产率(%)流产流产数临床妊娠数流产率(%)345561 8295552 743411 8325261 5285253 83329 4

3.不同精子来源组ICSI临床结局比较：新鲜精子组患者女方年龄(30.9±2.6)岁，基础FSH(7.1±2.2 )U/L，BMI指数(22.4±3.1)kg/m2，内膜厚度(11.0±1.8)mm，成熟卵数(9.0±2.2)个；冷冻精子组患者女方年龄(31.1±2.2)岁，基础FSH(7.4±2.2)U/L，BMI指数(22.8±3.6)kg/m2，内膜厚度(11.4±2.2)mm，成熟卵数(9.4±2.3)个。两组患者女方年龄、基础FSH、BMI指数、内膜厚度以及成熟卵数数据比较，差异无统计学意义。新鲜精子组和冷冻精子组患者正常受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率、临床妊娠率、活产率、流产率数据比较，差异无统计学意义。见表3。

表3 不同精子来源组ICSI妊娠结局比较

临床妊娠妊娠总人数移植总人数临床妊娠率(%)活产分娩活婴数移植周期数活产率(%)流产流产数临床妊娠数流产率(%)355761 4315754 43358 6315062 0265052 043112 9

讨论

无精子症一般是指患者的精液中没有精子，最新版世界卫生组织在男性不育的诊断检查及处理手册指明无精子症是指精液即使经过离心后检查亦不能发现精子。但是精液中未发现精子也不代表无精子症患者完全无法生育后代，部分无精子症患者，如输精管缺如、逆行射精或排精障碍的患者可通过睾丸或附睾穿刺获得精子，并通过ICSI技术来生育后代。经过近20年的发展，目前睾丸或附睾穿刺取精联合ICSI治疗梗阻性或者非梗阻性无精子症已经在辅助生殖技术领域得到广泛运用[2]，并取得良好的治疗效果。

本研究的目的是探索男方年龄、发病原因(梗阻性无精子症或非梗阻性无精子症)以及精子来源(新鲜或冷冻)等因素对ICSI临床结局的影响。近年来，女方年龄一直被认为是不孕和辅助生殖治疗失败的重要原因，因为女性随着年龄的增长，卵巢里的储备卵泡逐渐消失[2]，卵子的质量也在下降。然而本研究结果提示男方年龄对ICSI的结局没有影响，无精子症的病因也不影响受精率、卵裂率、临床妊娠率、活产率及流产率，这与相关学者[3]研究结论一致，也有其他学者的研究发现OA患者的受精率和临床妊娠率显著高于NOA患者，认为其主要原因是由NOA患者精子染色体的异常发生率增高所致[4]。有一些研究表明NOA患者采用新鲜精子和冷冻精子在ICSI结局方面无显著差异[5-6]，NOA患者并不能保证每次TESE都能找到精子，因此利用诊断穿刺时的冷冻精子行ICSI可以避免反复外科穿刺手术；这样不但能够减少反复穿刺对患者睾丸功能的影响，还能够减轻患者的焦虑情绪和经济负担[7]。也有研究认为新鲜精子来源的ICSI结局较好，冷冻精子会导致较低的受精率和临床妊娠率[8]，认为可能与睾丸来源的精子比自然排出的精子对低温更敏感有关[9]，冷冻过程中精子细胞内冰晶形成会导致顶体和细胞膜肿胀、破裂，同时在精子冷冻和解冻过程中氧自由基增加，导致细胞膜发生脂质过氧化作用，进而影响胚胎质量和妊娠结局。

在临床上，OA患者几乎100%能获得可用精子，而NOA患者只有50%的机会获得可用精子[10]。因此，对于NOA患者只要TESE获得可用精子，建议患者进行冷冻保存，以降低取卵周期发生无精子使用的风险。而对于OA患者，建议于取卵日行TESE，可以减少精子冷冻保存费用。

总之，本研究结果表明，无精子症患者一旦获得可用精子，ICSI临床结局不受男方年龄、病因及精子来源的影响。由于本研究标本量较少，有关男方因素对无精子症患者ICSI临床结局的影响有待大样本研究的进一步完善。

1 Devroey P,Liu J,Nagy Z,et al.Normal fertilization of human oocytes after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection.Fertil Steril,1994,62:639-641.

2 郑菊芬,王鹏,卢永宁,等.无精子症和严重少/弱精子症ICSI子代与其他精子ICSI/IVF子代出生缺陷的比较研究.生殖与避孕,2015,35:762-766.

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6 Mátyás S,Papp G,Kovács P,et al.Intracytoplasmic sperm injection with motile and immotile frozen-thawed testicular spermatozoa (the Hungarian experience).Andrologia,2005,37:25-28.

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8 Wasilewska K,Zasiadczyk,Fraser L,et al.The benefits of cooling boar semen in long-term extenders prior to cryopreservation on sperm quality characteristics.Reprod Domest Anim,2016,51:781-788.

9 彭向杰,王斯洋,范立青,等.精液长时间冷冻储存与冷冻复苏率的相关性研究.中国现代医学杂志,2015,25:101-103.

10 Gürler H,Malama E,Heppelmann M,et al.Effects of cryopreservation on sperm viability,synthesis of reactive oxygen species,and DNA damage of bovine sperm.Theriogenology,2016,86:562-571.