环状RNA在肝细胞癌中的差异表达研究

高鹏骥，陈雷，高杰，李照，王福顺，冷希圣，朱继业

（北京大学人民医院 肝胆外科/北京市肝硬化肝癌基础研究重点实验室，北京 100044）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的消化系统恶性肿瘤，严重危害患者的生命健康。尽管已经病毒性肝炎、酒精性肝病等HCC的高危因素已经明确[1-4]，但是具体的发病机制尚不清楚，早期诊断的临床生物标记物也有待进一步发掘。近年来，非编码RNA领域的进展为HCC的研究带来了新的希望，研究发现长链非编码RNA和微小RNA均在HCC与癌旁组织中存在差异表达，可能与肿瘤的生物学行为密切相关[5-6]。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是新近确认的一类特殊的非编码RNA分子，通过与疾病关联的miRNA相互作用，在疾病的发生发展过程中发挥着重要的调控作用[7-10]。文献[11-12]报道circRNA在结肠癌中存在特异性差异表达和基因调控功能，Li等[12-13]对胃癌和癌旁非肿瘤组织的研究发现，hsacirc002059在胃癌中的表达显著下调，有望成为诊断胃癌的标记物。circRNA是否在HCC中发挥作用，目前尚不明确。对其进行深入研究有可能为阐明HCC的发病机制、发现可用于早期诊断的生物学标志物取得突破。

本研究预期筛选出HCC中差异表达的circRNA，为HCC的早期诊断和治疗提供新的思路。

1　材料与方法

1.1　标本收集

3例HCC和对应的癌旁组织来源于2015年9月在北京大学人民医院接受肝癌切除手术的患者。患者的TNM分期均为I期，病灶为实性，最大径线分别为2.7、3.5、6.7cm。标本离体后10 min内取材，以生理盐水冲洗后装入冻存管投入液氮罐冷藏，随后转入-80 ℃冰箱保存至提取总RNA。HCC和癌旁组织均经病理证实。

1.2　circRNA芯片实验操作流程

总RNA提取：取100 mg标本，应用RNA抽提试剂TRIzol（Invitrogen公司）按照试剂说明分别从HCC组织和癌旁肝组织提取总RNA，应用NanoDrop ND1000进行纯度和浓度测定；RNA标记：应用RNase R（Epicentre公司）处理总RNA，去除线性RNA，富集circRNA，应用随机引物按照Arraystar Supper RNA Labeling Protocol对circRNA进行扩增并转录为荧光cRNA；芯片杂交：将荧光标记的cRNA应用RNA提取试剂盒（Qiagen公司）纯化后在circRNA芯片（8×15 K，Arraystar公司）上杂交，于分子杂交仪（Agilent公司）65 ℃孵育17 h；芯片扫描：杂交后的芯片洗片后，应用Agilent Scanner G2505C扫描。

1.3　数据采集与分析流程

原始数据提取：将芯片扫描图片导入Agilent Feature Extraction软件（版本11.0.1.1）提取原始数据；数据分析：应用R软件包对原始数据进行标准化并进行分析，两组样本间差异表达的circRNA通过变化倍数进行筛选，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.4　生物信息学分析

根据差异表达变化倍数筛选circRNA，应用Arraystar的miRNA目标预测软件（一款基于TargetScan[14]和miRanda[15]的软件）预测与之相互作用的miRNA，文献检索已经证实的在肿瘤发生发展中具有重要作用的miRNA，初步确定在HCC中具有重要作用的circRNA。

2　结 果

2.1　识别具有统计学意义的差异表达的circRNA

与癌旁肝组织比较，HCC组织中的circRNA表达谱发生了明显变化（图1）。图1左侧/右侧红点分别表示在HCC中表达下调/上调的满足差异倍数1.5倍以上且具有统计学意义的circRNA。

图1　circRNA火山图Figure 1 Volcano plot of circRNAs

2.2　聚类分析circRNA表达谱的差异

绘制circRNA聚类图，结果显示在HCC和癌旁组织样本间circRNA的表达谱存在差异（图2）。

2.3　HCC中差异表达circRNA的筛选

将差异表达1.5倍以上且P＜0.05的circRNA确定为差异表达的circRNA。结果显示HCC组织和癌旁组织相比，1.5倍以上变化的circRNA共82条，其中上调的共21条，下调的共61条；5倍以上变化的共3条，其中上调的2条，分别为hsacirc-0043278和hsa-circ-0006220，下调的1条为hsacirc-0065214。部分差异表达的circRNA见表1。

图2　差异circRNA聚类图Figure 2 Clustering plot of the differentially expressed circRNAs

表1　部分差异表达的circRNATable 1 Part of the differentially expressed circRNAs

2.4　初步确定可能在HCC中具有重要作用的circRNA

应用Arraystar的miRNA目标预测软件对差异表达变化倍数较高的circRNA进行分析，得到可能与之相互作用的miRNA（表2）。通过文献检索发现，hsa-miR-520d-3p在胃癌和HCC组织中低表达，并与肿瘤恶性程度和化疗敏感性有关。

表2　应用Arraystar预测的可能与circRNA相互作用的miRNATable 2 The miRNAs that possiblly interacted with circRNAs predicted by Arraystar software

3　讨 论

circRNA是一类特殊的非编码RNA分子，大量存在于真核细胞，具有一定的组织、时序和疾病特异性[16-18]。circRNA又被称为miRNA海绵，含有miRNA的多个串联结合位点，通过竞争性结合miRNA来调控其表达，进而影响疾病的发生发展[19-20]。研究[21-22]显示，circRNA有望作为生物标记用于肿瘤的诊断和治疗。circRNA在HCC中的研究尚处于初级阶段，本研究结合芯片技术及生物信息学分析，希望在HCC组织中发现circRNA的差异表达，为HCC的诊断和治疗提供新的思路。

本研究中采用的circRNA芯片为Arraystar公司推出的全球首款circRNA芯片，采用特异性剪接位点探针与外切酶预处理双重保障，能够准确检测样本中circRNA的表达。借助芯片对HCC和癌旁组织提取的RNA进行分析，获得了HCC和癌旁组织中的circRNA表达谱。按照差异表达倍数≥1.5且P＜0.05进行筛选，获得了82条差异表达的circRNA。其中上调的共21条，下调的共61条；5倍以上变化的共3条，其中上调的2条，下调的1条。在HCC组织中有circRNA的明显上调和下调，提示这些circRNA可能参与了HCC的发生、发展及分子调控过程。

对82条具有统计学意义的差异表达的circRNA进行分析发现，有3条circRNA差异表达倍数较高，且在3对样本中具有较好的一致性。通过生物信息学软件预测出这3条circRNA可能结合的miRNA后，通过文献检索发现，已有研究证实与hsa-circ-0043278和hsa-circ-0006220存在结合位点的hsa-miR-520d-3p在胃癌和HCC的发生发展过程中具有调控作用[23-25]。研究显示，hsa-miR-520d-3p能够抑制肿瘤的增殖和转移，hsa-miR-520d-3p水平下调将导致不良预后。因此，初步确定hsa-circ-0043278和hsa-circ-0006220可能在HCC中具有重要作用。

本研究的局限性在于仅选取了3对样本进行分析，数量相对较少，存在一定的偶然性；实验采用的芯片为Human Circlar RNA Array V1.0，有许多新近发现的circRNA未纳入；通过生物信息学预测和文献检索确定的hsa-circ-0043278和hsacirc-0006220尚未进行实验验证。下一步将增加样本量进行芯片杂交分析，对初步确定的circRNA进行qRTPCR验证，构建慢病毒载体转染HCC细胞，进行功能实验。

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