乙型肝炎病毒耐药检测研究进展
2017-03-29李军
李军
[摘 要] 核苷(酸)类似物(NA)是目前临床治疗乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染的首选方案,但随着治疗时间的延长,HBV耐药性的产生极易对治疗效果造成影响。HBV耐药性检测包括基因型耐药和表型耐药分析两种手段,其中前者可明确HBV基因组中已知与耐药相关的病毒变异,在近年来病毒耐药性检测领域受到了广泛关注。本文就HBV耐药原因以及DNA直接测序技术、焦磷酸测序技术等十余种基因型耐药检测方案进行综述,旨在为强化HBV耐药管理提供参考。
[关键词] 乙型肝炎病毒;耐药;检测;进展
中图分类号:R446 文献标识码:A 文章编号:2095-5200(2017)01-025-03
DOI:10.11876/mimt201701010
据世界卫生组织(WHO)统计,目前全球乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)慢性感染者为3.5亿,其中30%患者已进展至肝硬化阶段,需及时实施长期、有效的抗病毒治疗[1]。干扰素和核苷(酸)类似物(NA)两大类抗病毒药物是目前临床治疗HBV感染的主要药物,其中,NA以其服用方便、安全性高、抑制病毒复制作用明确等优势,得到了广泛应用[2]。但其缺陷在于,需长期服用方可将HBV抑制在较低水平,降低肝硬化、肝癌等继发疾病发生风险,而长期服用NA可诱导HBV耐药突变的发生,加之近年来低耐药屏障NA序贯应用的逐步推广,HBV多药耐药为临床治疗带来了更为严峻的挑战[3-4]。本文就HBV耐药机制、耐药检测及防治策略进行综述,旨在为HBV耐药的监测与分析提供参考。
1 HBV耐药原因
1.1 HBV耐药机制
缺乏校正的逆转录伴随着HBV复制的全过程,若HBV基因突变位点恰好处于HBV-DNA聚合酶的逆转录区域,则极有可能导致耐药性的产生[5]。应用抗病毒药物治疗前,慢性乙肝患者体内往往并不存在耐药株,均为野生株,但抗病毒药物对HBV的选择性作用,可逐渐导致药物敏感野生株逐渐减少、耐药株获得生存,继而成为优势病种株,最终引发HBV总体耐药性的产生[6]。
1.2 HBV耐药因素
研究表明,药物的空间结构、基因屏障及药代动力学特征均在耐药性的产生环节扮演了重要角色[7]。如拉米夫定与三磷酸脱氧胞苷(dCTP)结构差异明显,但阿德福韦酯与dCTP十分接近,故前者更易发生HBV耐药。Lee等[8]发现,拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定在发生耐药变异时,HBV耐药株仅1个位点发生突变,而恩替卡韦耐药株需在上述突变基础上发生3个位点联合突变,故初治患者恩替卡韦耐药率极低。若抗病毒药物可同时强烈抑制野生株、耐药株复制,则其药代动力学优势可保证HBV处于较低的耐药性。除抗病毒药物自身因素外,患者HBV-DNA定量、病程、年龄、依从性、治疗方案、病情等基础状态亦可对HBV耐药性造成明显影响[9]。
1.3 HBV耐药分类
HBV耐药包括基因耐药、交叉耐药两种类型,其中基因耐药即为HBV基因序列发生耐药相关基因突变,若该基因突变导致病毒株对药物敏感性降至野生株的25%以下,则被称为表型耐药;交叉耐药是指病毒在发生基因耐药的同时,不仅对某一种药物耐药,且同时对另外一种无关药物存在耐药性。目前临床常用抗病毒药物的耐药性分别为:拉米夫定20%~69%,阿德福韦酯11%~29%,恩替卡韦9%,替比福定2%~4%,随用药时间的延长,其耐药性不断增加[10]。
2 HBV耐药检测
2.1 DNA直接测序技术
DNA直接测序技术是最为经典的HBV耐药检测方法,在所有耐药变异检测技术中,DNA直接测序技术的准确性、特异性均处于较高水平,且多数学者均将该技术作为检测其他技术功效的对比标准[11]。但由于该技术耗时久、经济性差、技术落后、检出限高达20%,且易出现混合感染中少量HBV感染的漏检,近年来应用逐渐减少。
2.2 焦磷酸测序技术
焦磷酸测序在DNA直接测序技术的基础上发展而来,是借助DNA合成过程中释放的焦磷酸判断HBV耐药情况的新型酶级联二代测序技术,与过往Sanger法ddNTP参与的链终止反应相比,该技术不需电泳、荧光标记,且分析快速、灵敏度高,可实现自动化定量分析。有学者将该技术用于HBV突变质粒标准品的检测,发现该技术10 min即可完成接近100份样本的检测,且检出限低至4%[12]。但其不足之处在于阅读长度仅为40 bp,覆盖范围有限,故罗氏最新研发的454 GS FLX测序平台在该技术的基础上进一步优化,提供了超深度焦磷酸测序技术,将其阅读长度延伸至250 bp,檢出限进一步升至1%,其高灵敏度、特有基因频率分析功能得到了广泛认可,但同时也大大增加了设备成本以及数据复杂性,临床推广受限[13]。
2.3 拉链核酸检测技术
拉链核酸(ZNA)是一种寡核苷酸,可以拉链形式连接互补核苷酸,故被称为“拉链核酸”,其可被阳离子精胺衍生物单元(Z单元)修饰,进而减少核苷酸链之间负电荷排斥力、提升引物和探针退火温度,在增强双链杂交稳定性及错配识别能力方面具有重要作用[14]。由于ZNA的Tm值仅受Z单元数量、寡核苷酸链长度影响,其探针设计极为简便、灵活。有学者针对HBV YMDD、YVDD、YSDD、YIDD序列设计不同的探针,发现该技术突变病毒载量检测底线可达35 copies/mL,是其他技术检测底线的300倍以上,且其灵敏性、特异性均较高,为野生、突变株的定量比例计算提供了可能,亦可动态监测耐药株比例的实时变化[15]。其缺陷在于,需针对不同位点设计不同ZNA探针,虽然探针设计较为简便,但仍为临床工作者增加了较大的工作量负担。
2.4 AllGlo探针实时荧光PCR技术
目前TaqMan探針、分子信标、杂交探针、双链置换探针等实时PCR探针应用十分广泛,在此基础上,AllGlo探针不仅具有上述探针全部的优点,还具有更高的荧光强度、检测灵敏度、特异性及广泛的可选荧光种类,有学者将AllGlo探针同时用于四种人乳头瘤病毒的单管检测,取得了良好的效果[16]。Kitrinos等[17]设计HBV YMDD、YIDD、YVDD的针对性AllGlo探针,发现其检测限达50 copies/mL,且与直接测序法比较未发现不一致结果,显现出该技术较高的准确性。需要注意的是,AllGlo探针在保持高灵敏度的同时,对靶序列保守性的要求极高,故在突变率较高的HBV耐药性检测方面,适用性不够广泛。
2.5 量子点DNA荧光共振能量转移传感器技术
量子点DNA荧光共振能量转移(QDs-DNA-FRET)技术在单核苷酸多态性、微量DNA的检测中得到了广泛关注,其检测方法仅需3步,分别为连接量子点表面形成功能性QDs-DNA连接体、向连接体内加入报告探针、应用FRET及寡核苷酸连接酶检测反应测定荧光信号。突变型HBV存在的单碱基错配可导致QDs-DNA复合体杂交失败,故无法参与FRET反应,亦无荧光信号产生[18]。其优势在于无须PCR扩增、特异性佳,且具有高效性、快速性,可同时实施多位点检测,同时,检测设备仅需多标记分析仪,易于临床实验室推广。但该技术亦需应用大量配套特殊试剂,是限制其推广的主要原因。
2.6 PCR侵入技术
与其他PCR技术的差别在于,PCR侵入技术不是对目的核酸进行扩增,而是实施探针信号扩增,通过侵入探针、信号探针、靶核酸分子检测和侧翼核酸内切酶3个体系,该技术可迅速分开荧光基团与淬灭基团,其检测下限为10 copies/mL,耐药病毒株检测比例可低至2%,且其对信号DNA进行扩增可大大降低检测过程中造成的污染,具有较强的特异性[19]。该技术的不足之处与ZNA检测技术类似,即需根据不同位点设计对应的侵入探针、信号探针,在一定程度上增加了检测的烦琐度。
2.7 限制性片段长度多态性技术
限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术主要借助DNA限制性内切酶特性,切割已知HBV耐药突变并行PCR扩增,从而区分HBV耐药突变与非HBV耐药突变。其优势在于操作简便、一次性可检测大量突变、灵敏度和特异性均较高,但其优势也同样明显,即对于变异快速的HBV,无法及时制作针对性限制性内切酶,导致检测失败。此外,Ayres等[20]指出,若扩增产物可被限制性内切酶识别,则可能导致目标片段酶活性竞争,影响检测结果。
2.8 基质辅助激光解吸离子飞行质谱技术
基质辅助激光解吸离子飞行质谱(MALDI-TOF-MS)技术是近年来新兴的一种HBV耐药检测技术,其主要分析野生型HBV与变异型HBV间分子量差别,以明确耐药基因突变,其重复性、特异性、灵敏度均较高,但检测限仅为100 copies/mL,不及上述其他技术[21]。
2.9 其他技术
目前实验室明确HBV耐药株的方法多种多样,除上述8种技术外,还存在肽核酸分析技术、基因芯片技术、连接酶检测反应技术、线性探针杂交法、依赖转染细胞模型的表型耐药检测等[22-26],为DNA直接测序的替代提供了新的方向,但各种技术也或多或少的存在一定缺陷,如肽核酸分析技术的突变株结果难以解释、基因芯片技术成本极高、连接酶检测反应技术检测限偏高、线性探针杂交法易漏检、依赖转染细胞模型仅可明确表型耐药但无法了解基因型耐药等。因此,如何综合上述技术的优势,尽可能寻求一种安全、经济、可靠、简便的检测方案,仍是医学工作者需要继续努力的方向。
3 展望
HBV耐药是乙型肝炎长期治疗中的最大难题,密切检测HBV耐药甚至多重耐药的发生,方为降低严重临床结局发生风险、改善患者预后质量的关键。当前关于抗病毒药物耐药的技术众多,且多数处于起步阶段,适用性、推广性均较为有限,对于各类现象、规律的认知亦不够完善。但各类技术在近几年已取得了飞速的发展,医学工作者亦朝着低成本、高通量技术方向不断努力,未来HBV耐药检测可着力于明确HBV耐药演变,了解HBV耐药发生发展关联。同时,随着耐药突变的早期检出,有望涌现出更多靶标抗病毒药物,为抗病毒治疗方案的个体优化、临床疗效的提升、患者预后的改善及HBV耐药株的减少提供更多可能性。
参 考 文 献
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