生物预处理秸秆降解木质素条件的优化

郑渊洁，郝建宇，侯红萍

(山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801)

生物预处理秸秆降解木质素条件的优化

郑渊洁，郝建宇，侯红萍*

(山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801)

[目的]优化黄孢原毛平革菌生物预处理降解玉米秸秆中木质素的条件。[方法]通过单因素和正交试验，分析不同pH、温度、接种量和时间对黄孢原毛平革菌降解木质素的影响。[结果]黄孢原毛平革菌降解玉米秸秆木质素的最适条件为：温度32 ℃，pH=6,接种量10片，时间15 d。[结论] 在最适条件下，还原糖得率由0.47 g·L-1提高到0.79 g·L-1。本研究可提高玉米秸秆中纤维素的利用率可用于后续研究。

木质素； 黄孢原毛平革菌； 降解率； 玉米秸秆

农作物秸秆富含纤维素、半纤维素、木质素，是一种产量丰富的可再生资源。木质素和半纤维素以共价键的形式结合将纤维素分子包裹，且结构较为紧密，阻碍纤维素酶与纤维素接触，影响秸秆的降解速率。木质素是影响秸秆利用率的主要因素[1,2]。一定的条件下，纤维素可以被水解为单糖，通过微生物发酵生产乙醇，提高农作物秸秆的利用率[3]。白腐菌分泌木质素降解酶系，降解木质素能力较强。适宜条件下，白腐菌分泌的酶降解秸秆表面的蜡质层，随后产生纤维素酶、半纤维素酶、过氧化物酶系，使木质素彻底降解[4,5]。黄孢原毛平革菌是白腐菌中降解能力较强的一种[6]。诸多研究表明，白腐菌处理后的秸秆，大部分的木质素可被降解，碳水化合物转化为单糖更加迅速，有利于后续酶的进行[7,8]。

1 材料与方法

1.1 菌种

黄孢原毛平革菌：购于中国微生物菌种保藏管理中心CICC。

1.2 原料

玉米秸秆，取自山西省太谷县，剪至1 cm长度，80 ℃烘干至恒重。

1.3 培养基

黄孢原毛平革菌平板培养基：马铃薯提取液1.0 L，葡萄糖20 g， KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，琼脂15 g，酵母膏0.1 g，pH自然。

黄孢原毛平革菌液体培养基:液体培养基[9]，5 g秸秆，5 g麸皮。

1.4 液体菌种的制备

活化的黄孢原毛平革菌接种至平板培养基，30 ℃培养4 d，待菌丝长满培养皿，采用直径8 mm已灭菌的打孔器打孔，得菌饼。将获得的菌饼接种于100 mL/250 mL三角瓶中。

1.5 单因素试验设计

1.5.1 接种量秸秆木质素降解率的影响

设置不同接种量5、10、15、20、25、30片，温度为32 ℃，初始pH为5。将菌饼接分别接种于装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，重复试验3次，140 r·min-1培养10 d，计算木质素降解率，求平均值。

1.5.2 温度对秸秆木质素降解率的影响

设置不同培养温度28、30、32、34 ℃，初始pH值为5，接种量为10片。将菌饼分别接种于装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，重复试验3次，140 r·min-1培养10 d，计算木质素降解率，求平均值。

1.5.3 pH对秸秆木质素降解率的影响

设置不同初始pH 3、4、5、6，固定培养温度为32 ℃。接种量为10片。将菌饼分别接种于装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，重复试验3次，140 r·min-1培养10 d，计算木质素降解率，求平均值。

1.5.4 时间对秸秆木质素降解率的影响

固定pH为5，接种量为10片。将菌饼接种于装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，重复试验3个，140 r·min-1、30 ℃培养，分别在第5、10、15、20、25、30天计算木质素降解率，求平均值。

1.6 正交试验设计

表1 L9(34)正交试验因素水平表

Table 1 L9 (34) Factors and levels of L9 (34)experiments

水平Levels因素Factors接种量/片InoculumsizepH温度/℃Temperature18430210532312634

1.7 木质素含量的测定

[10]。

1.8 还原糖含量的测定

DNS法测定还原糖含量[11]。

1.9 葡萄糖标准曲线的绘制

分别向试管中加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 1 g·mL-1葡萄糖溶液，分别加入3 mLDNS溶剂，加热煮沸5 min,冷却，定容至25 mL，摇匀，于波长540 nm[12]处测定吸光值，以含糖量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标曲，得曲线方程。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

由图1可见，葡萄糖标准曲线的线性回归方程为：y=0.561 5x+0.017 9，拟合度R2=0.992 21，表明此标准曲线线性关系良好。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 接种量对木质素降解率的影响

由图2可见，接种量对秸秆中木质素降解率的影响先增加后降低，在10片时达到峰值43%，20片时降解率最低38%。接种量在10片时菌丝体生物量与降解底物达到最适搭配，过少底物不能充分接触菌丝体，接种过多菌丝体底物不能充分利用，菌丝生长占据了主导地位。

图2 接种量对木质素降解率的影响Fig.2 Effect of inoculation amount on degradation rate of lignin

2.3 温度对木质素降解率的影响

由图3可见，温度对黄孢原毛平革菌降解秸秆木质素的影响呈钟罩形曲线，随着温度的升高降解率先升高而后降低，在32 ℃是达到最大值，降解率达到44%。降解木质素是通过酶起作用，32 ℃为最适宜温度。

2.4 pH对木质素降解率的影响

由图4可见，初始pH对黄孢原毛平革菌降解秸秆木质素的影响呈钟罩形曲线，即随着pH的升高，降解率先升高而后降低，在初始pH为5时降解率达到最大值43%。黄孢原毛平革菌降解木质素的酶为酸性酶系，最适初始pH为5。

2.5 时间对木质素降解率的影响

由图5可见，在接种5 d时，木质素降解率较低，此时黄孢原毛平革菌处于生长繁殖期。处理10 d、15 d以木质素的降解率明显增高。此时，黄孢原毛平革菌大量形成，开始作用于底物，起降解作用。木质素降解的最佳时间为15 d。

图5 时间对木质素降解率的影响Fig.5 Effect of time on lignin degradation rate

2.6 降解木质素正交试验结果

黄孢原毛平革菌降解木质素的过程中，接种量、温度、pH、时间都对降解率有影响。以木质素降解率为指标，进行正交试验。试验结果见表2和表3。

表2 L9(34)正交试验结果

表3 正交试验方差分析

由单因素试验和正交试验可以得出黄孢原毛平革菌降解木质素影响因素的大小依次为：A、C、B即接种量>pH>温度，最佳条件为A2B2C3，即接种量10片，温度32 ℃，pH=6，在最优条件下木质素降解率达到47%。

2.7 还原糖含量的测定

黄孢原毛平革菌发酵秸秆15天，接入8%的纤维素酶液，继续培养6天，测得还原糖含量0.79 g·L-1。对比组前15天未加入黄孢原毛平革菌，后接入8%纤维素酶发酵6天，测得还原糖含量0.47 g·L-1。

3 结论

黄孢原毛平革菌降解秸秆中木质素的影响因素很多，主要研究了接种量、温度、pH、时间4个因素。通过优化黄孢原毛平革菌降解木质素的条件，得到最优发酵条件：最佳条件为：接种量10片，pH=6，温度32 ℃，接种时间为15天。黄孢原毛平革菌最优条件下发酵培养15天后接入纤维素酶混合菌降解纤维素，还原糖得率较未优化前由0.47 g·L-1提高到0.79 g·L-1。

参 考 文 献

[1]赵林果,金耀光,李强,等.白腐菌及黑曲霉所产纤维素复合酶对稻草秸秆的生物降解[J].中国生物工程杂志,2007,27(3):71-75.

[2]杨世关，李继红，孟卓，等.木质纤维素原料厌氧生物降解研究进展[J].农业工程学报,2006,22(增刊Ⅰ):120-124

[3]张立霞,纤维降解菌组合的筛选、优化及对玉米秸秆的降解效果[D].北京:中国农业科学院,2014.

[4]张玉辉,肖文显,贾翠英,等.黄孢原毛平革菌降解玉米秸秆禅堂条件的优化[J].安徽农业科学,2010,38(11):5857-5859.

[5]王伟,白腐菌预处理与酶解转化杨木研究[D].北京：北京林业大学，2014.

[6]徐伟,王金凤,范洪臣,等.黄孢原毛平革菌发酵稻草秸秆降解木质素的研究[J].农产品加工，2014(11):10-16.

[7]王义刚，吴淑芳，刘刚，等.白腐菌预处理对稻草化学组分及酶水解的影响[J].纤维素科学与技术,2013,21(3);16-22.

[8]许敬亮,尹依婷,张宇,等.白腐菌预处理稻草秸秆对Z28产纤维素酶的影响[J].太阳能学报，2010,31(8):955-957.

[9]张慧芳，混菌发酵产纤维素酶的分离纯化及其酶学性质研究[D].山西农业大学，2014.

[10]王金主,王元秀,李峰,等.玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的测定[J].山东食品发酵,2010,3：44-47.

[11]齐香君,苟金霞,韩戌珺,等.3,5-二硝基水杨酸比色法测定溶液中还原糖的研究[J].纤维素科学与技术,2004,12(3):17-19.

[12]杜苏萌,赵金安,等.利用黑曲霉和酵母共发酵秸秆产乙醇的研究[J].太原师范学院(自然科学版),2012,11(3):132-134.

(编辑：马荣博)

Optimization of lignin degradation conditions for biological pretreatment of corn straw

Zheng Yuanjie, Hao Jianyu, Hou Hongping*

(CollegeofFoodScienceandEngineering，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801,China)

[Objective]The research aimed to optimize the conditions of corn straw degradstion byPhanerochaetechrysosporium.[Methods]Influences of different pH,temperatures.inoculum concentration and time of degradstion ofPhanerochaetechrysosporiumwere analyzed by respectively using single factor design and orthogonal design. [Results]The optimum conditions for the degradation of lignin were as follow: the temperature 32 ℃,the initial pH 6,the inoculum concentration 10 piece,10 days.[Conclusion]Under the optimum conditions,the yield of reducing sugar increased from 0.47 g·L-1to 0.79 g·L-1.The research can improve the utilization ratio of cellulose in corn straw, and further apply to the next step.

Lignin， Phanerochaete chrysosporium， Degradation rate， Corn straw

2016-08-24

2016-11-09

郑渊洁(1991-)，女(汉)，山西太原人，硕士，研究方向：食品微生物与发酵技术

*通信作者：侯红萍，教授，研究生导师，Tel:15934425958，E-mail:sphhping@126.com

山西省科技攻关项目(No.201403110192)

Q93-335

A

1671-8151(2017)03-0214-03