超声波辅助提取草莓多酚的工艺优化

李芬芳，马艳弘，赵密珍，黄开红，段云青

(1.山西农业大学 文理学院，山西 太谷 030801； 2.江苏省农业科学院 农产品加工研究所，江苏 南京 210014;3.江苏省农业科学院 园艺学院，江苏 南京 210014； 4.万山红遍生物科技有限公司，江苏 句容 212403)

超声波辅助提取草莓多酚的工艺优化

李芬芳1,2，马艳弘2，赵密珍3，黄开红4，段云青1*

(1.山西农业大学 文理学院，山西 太谷 030801； 2.江苏省农业科学院 农产品加工研究所，江苏 南京 210014;3.江苏省农业科学院 园艺学院，江苏 南京 210014； 4.万山红遍生物科技有限公司，江苏 句容 212403)

[目的]采用响应面分析法优化草莓多酚的超声波辅助提取工艺参数，为草莓多酚的产业化生产提供参考。[方法]考查了料液比、乙醇浓度、超声功率及超声时间对草莓中多酚得率的影响，在单因素试验结果的基础上用Box-Benhnken法进行3因素3水平的试验设计,以多酚得率为响应值，对所得数据进行整理分析，并建立二次多项回归数学模型，优化草莓多酚的提取工艺。[结果]超声波辅助乙醇提取草莓中总多酚最佳工艺为：当料液比为1∶30 g·mL-1时，乙醇浓度60%，超声功率585 W、超声时间25 min，在此条件下草莓多酚得率为10.959 mg·g-1。[结论]与常规提取法相比，超声波辅助提取工艺提取率具有提取时间短，提取溶剂用量少，提取效率高的优点。

草莓； 多酚； 超声波辅助提取； 响应面法

草莓(FragariaananassaDuch)是世界七大水果之一[1]，别名红莓、蛇莓等,属蔷薇科草莓属多年生草本植物，其肉质红嫩、酸甜爽口，富含多酚、花色苷、维生素C、多糖以及其他次生代谢产物[2,3]，抗氧化活性强[4～6]，具有预防动脉硬化、降血脂、降血压以及增强免疫力等多种生理功能[7～9]，在国内外市场极其畅销。其中植物多酚作为草莓最主要的抗氧化物质基础，已成为众多研究者关注的焦点。

目前，草莓多酚的提取主要采取有机溶剂萃取法，具有溶剂用量大、提取率低、对生物活性破坏大、容易造成环境污染等缺点，很难实现产业化生产。而超声提取法可利用超声波所特有的空化效应破坏植物细胞壁，使植物中的生理活性物质在较低温度下实现释放、扩散及溶解，具有常规提取法提取不可比拟的优势[10,11]。目前多酚的超声提取仅在蓝莓、茶叶、石榴等少数植物中研究报道，有关草莓多酚的超声辅助提取法仍未见报道。鉴于此，本研究采用超声波辅助提取法提取草莓多酚，并通过响应面分析法中的Box-Benhnken实验设计，进一步优化其工艺参数，以期为草莓多酚的产业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宁玉草莓：由江苏省农业科学院园艺研究所提供，所有草莓从基地随机采摘，挑选出无物理损伤成熟度一致的鲜草莓供试验使用；福林酚试剂(1N)：购自源叶生物技术有限公司；无水乙醇、没食子酸、碳酸钠：购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

FDU-1200真空冷冻干燥机：南京载智自动化设备有限公司；FW100高速万能粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；DK-8D型电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；KH-500E型变频超声波仪，昆山禾创超声仪器有限公司；UV-1600型紫外可见分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；JJ-500电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；XO-1000D超声波细胞破碎仪，南京先欧仪器制造有限公司；TGL-16B台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 草莓多酚得率测定[12]

多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法测定。

1.3.2 标准曲线的绘制

配制浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g·L-1的没食子酸标准溶液分别取1 mL，加5 mL蒸馏水，1 mL Folin-Ciocalteu显色剂，3 mL 7.5%碳酸钠溶液，混匀，45 ℃水浴1.5 h后，于760 nm处测定吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线，所得回归方程为：y=0.0113x+0.002，相关系数R2=0.9998。

1.3.3 多酚提取得率的测定

取1 mL草莓多酚提取液，依次加入5 mL蒸馏水，1 mL Folin-Ciocalteu显色剂，3 mL 7.5%碳酸钠溶液，混匀，45 ℃水浴1.5 h，在760 nm处测吸光度。按照所得标准曲线计算草莓多酚含量，再按照如下公式计算多酚提取得率：

多酚得率(按没食子酸计)/mg·g-1=(C×v/m)×100%，

式中，C为多酚质量浓度/g·L-1；v为多酚提取液总体积/mL；m为草莓粉总质量/g。

1.3.4 单因素试验设计

以冻干的宁玉草莓粉为提取原料，提取液为一定质量浓度的乙醇溶液，分别考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g·mL-1)、乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)、超声功率(200、300、400、500、600、700 W)、超声时间(5、10、15、20、25、30 min)对草莓多酚提取率的影响，确定草莓多酚提取的最适提取条件。

1.3.5 Box-Benhnken试验设计

在草莓多酚提取单因素试验结果的基础上，选取乙醇浓度、超声功率、超声时间3因素为自变量，以多酚得率为响应值，采用Box-Benhnken中心组合法设计3因素3水平的优化试验，通过响应面分析法优化草莓中多酚的最佳提取工艺条件。试验因素与水平见表1。

表1 草莓多酚超声波辅助乙醇提取工艺响应面分析试验的因素与水平

Table 1 Variables and their coded levels in response surface analysis

水平Level因素FactorsA:乙醇浓度/%EthanolconcentrationB:超声功率/WUltrasounicpowerC:超声时间/minUltrasounictime-140400150505002016060025

2 结果与分析

2.1 草莓多酚提取单因素试验

2.1.1 料液比对草莓多酚得率的影响

固定乙醇浓度为50%，超声波功率为500 W，超声时间为20 min，考察料液比对草莓多酚得率的影响，结果见图1。如图1所示，在料液比小于1∶30(g∶mL)范围内，多酚得率随着溶剂量逐渐增大逐渐提高；当达料液比达1∶30(g∶mL)时，多酚得率可高达17.52 mg·g-1。继续增大料液量，提取率不发生显著变化，故可确定草莓多酚提取的最适料液比1∶30(g∶mL)。

图1 料液比对草莓多酚提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphenolic from strawberry

2.1.2 乙醇浓度对草莓多酚得率影响

固定草莓多酚提取的料液比为1∶20 g·mL-1，超声波功率为500 W，超声时间为20 min，考察乙醇浓度对草莓多酚得率的影响，结果见图2。如图2所示，当乙醇浓度小于50%时，草莓多酚得率随着乙醇浓度的增大而逐渐提高，当乙醇浓度为 50%时，草莓多酚的得率为11.54 mg·g-1；反之，乙醇浓度大于50%后，草莓多酚得率随着乙醇浓度的增大而逐渐降低。这可能是由于过高浓度的乙醇溶液会引起细胞蛋白质的变性，或是导致了溶剂与多酚极性差异逐渐增大，致使多酚得不到充分的溶解，从而导致了得率的降低[13]。由此确定草莓多酚提取的最佳乙醇浓度为50%。

图2 乙醇浓度对草莓多酚得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenolic from strawberry

图3 超声波功率对草莓多酚得率的影响Fig.3 Effects of ultrasounic power on extraction rate of polyphenolic from strawberry

2.1.3 超声功率对草莓多酚的率影响

固定料液比为1∶20 g·mL-1，50%的乙醇溶液，超声时间20 min，考察超声功率对草莓多酚得率的影响，结果见图3。由图3可以看出，随着超声功率的提高，草莓多酚得率逐渐提高，到超声波功率达到500 W时，草莓多酚得率达到最大；之后随着超声波功率的增加，多酚得率呈现下降的趋势。这主要是由于较高超声功率的空化作用致使提取体系高温升高，从而导致了多酚的降解。据此可确定草莓多酚的最佳提取超声功率为500 W。

2.1.4 超声时间对草莓多酚提取影响

图4 超声时间对草莓多酚得率的影响Fig.4 Effects of ultrasounic time on extraction rate of polyphenolic from strawberry

固定料液比1∶20 g·mL-1，乙醇浓度为50%，超声波功率为500 W，考察不同超声时间对草莓多酚得率的影响，结果见图4。由图4可知，当超声时间为20 min 时，多酚得率最高；当超声时间大于20 min 时，多酚得率呈下降趋势。这是由于长时间的超声波作用积累了较多热量，从而导致了多酚类降解。因而可确定草莓多酚提取的最佳超声时间为20 min。

2.2 响应面分析法优化工艺条件

2.2.1 响应面法设计及结果分析

在单因素试验基础上，选取乙醇浓度(A)、超声功率(B)、超声时间(C)为因素，草莓多酚得率为响应值，按照Box-Benhnken试验设计原理，通过响应面分析法优化草莓多酚的提取工艺条件。其试验结果见表2。

应用Design Expert8.0.6.1软件对试验结果进行多元回归分析，得到的回归方程为：

Y=10.26+0.38A+0.43B+0.28C+0.16AB+0.054AC+0.22BC-0.35A2-0.46B2-0.30C2

(1)

表2 草莓多酚超声波辅助乙醇提取工艺响应面分析试验设计及结果

Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

序号NumberA:乙醇浓度/%EthanolconcentrationB:超声功率/WUltrasounicpowerC:超声时间/minUltrasounictimeY:多酚得率/mg/gYieldoftotalpolyphenols100010.25420-119.1443-1-108.858410-19.708501110.4856-10-19.0137-1019.401811010.356901-19.4241000010.4021110110.311120-1-18.9471300010.11214-109.332151-109.236

表3 方差分析结果

注：**，影响极显著，P<0.01；*，影响显著，P<0.05；N，影响不显著，P>0.05。

Note: **, the effect is very significant,P<0.01; *, the effect is significant,P<0.05; N, the effect is not significant,P>0.05.

图5 乙醇浓度、超声功率及超声时间单的交互作用对草莓多酚得率的影响Fig.5 Response surface plot for the effect of cross-interaction between ethanol concentration , ultrasound power, ultrasound time on the extraction rate of polyphenols from strawberry

2.2.2 响应面图分析与优化

绘制乙醇浓度、超声功率、超声时间等3个变量之间交互作用的响应面图和等高线图，由图5a可见，乙醇浓度与超声功率交互作用的响应面坡度较陡，二者交互作用显著[15,16]；同一超声功率下，随着乙醇浓度的增加，提取率增加；与之相比，在同一乙醇浓度的水平下，随着超声功率的增加，提取率达到最高后随即下降。由5b可见，乙醇浓度与超声时间交互作用的响应面坡度较平缓，等高线呈圆形，说明二者交互作用不显著，随着乙醇浓度和超声时间的增加，提取率增加幅度均较为缓慢。由图5c可见，超声功率与超声时间交互作用的响应面坡度较陡，等高线呈椭圆状，二者交互作用较显著；在同一超声时间下，随着超声功率的增大多酚得率增加较快；与之相比，在同一超声功率的水平下，随着超声时间的增加，多酚得率增加幅度缓慢。通过以上分析可得出，乙醇浓度、超声功率对多酚提取量影响比较大，超声时间对多酚提取量影响最小，与方差分析结果一致。

2.2.3 响应面最优提取工艺条件及验证试验

通过软件分析得到草莓多酚超声波辅助乙醇最佳提取工艺：乙醇浓度为60%，超声功率为584.54 W，超声时间为24.36 min。在此条件下，草莓多酚得率为10.675 mg·g-1。为了操作方便，修正最佳提取工艺条件为：在超声功率为585 W，料液比为1∶30 g·mL-1的条件下，选择乙醇浓度为60%，超声时间为25 min进行3次平行试验，多酚得率平均值为10.959 mg·g-1，实测值与预测值接近，表明此回归模型科学可靠，可以用来预测超声波辅助乙醇提取草莓多酚。

3 结论

草莓是国内外市场上深受消费者喜爱的特色保健浆果，但草莓的易腐特性常常会导致草莓丰产不丰收。因此，采用深加工技术开发各类草莓多酚营养保健品是草莓产业发展的必然途径。

本研究在单因素试验基础上，选取乙醇浓度、超声功率及超声时间三个因素进行响应面分析，通过Box-Benhnken试验设计，通过响应面分析法发现乙醇浓度、超声功率、超声时间3个因素对草莓多酚得率的影响程度大小依次为：超声功率>乙醇浓度>超声时间；草莓多酚的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度60%，超声功率585 W、超声时间25 min，在此条件下试验得到的多酚提取率(按没食子酸计)为10.959 mg·g-1。验证试验表明该数据与模型预测值极其接近，表明了响应面法分析获得的回归模型能够可靠地对草莓多酚得率进行分析和预测。该工艺节能环保，可以为草莓多酚的工业化生产起到很好的指导作用，为草莓产品的深加工提供进一步的工艺参数。

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(编辑：马荣博)

Optimization on polyphenols ethanol extraction from strawberry by ultrasonic-assisted

Li Fenfang1,2, Ma Yanhong2, Zhao Mizhen3, Huang Kaihong4, Duan Yunqing1*

(1.CollegeofArtsandSciences,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.InstituteofAgriculturalProductsProcessing,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,China; 3.InstituteofHorticulture,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,China; 4.WanshanhongbianBiotechnologyLtd.,Jurong212403,China)

[Objective]To optimize the ultrasonic-assisted extraction parameters of total polyphenols in strawberry by response surface methodology, in order to provide reference for industrial production of strawberry polyphenols.[Methods]The influence on the technology caused by the liquid-to-solid ratio, ethanol concentration, ultrasonic time and ultrasonic power were investigated. The data were analyzed by Box-Benhken central composite experiment design depended on the results of single-factor experiments. Response surface analysis was applied to create the two multinomial mathematical in order to optimize the extraction process of polyphenol from strawberry. [Results]When the ratio of material to liquid was 1∶30 g · mL-1，the results showed that the optimum parameters for extracting from strawberry were 60% ethanol，ultrasonic power 585 W，ultrasonic time 25 min. Under the condition, the yield of strawberry polyphenols was 10.959 mg·g-1. The results showed that the extraction yield of strawberry by ultrasonic extraction was higher than it of the ethanol refluxing extraction，ultrasonic extraction was faster and needed less solvent，which were superior to solvent extraction method.

Strawberry, Total polyphenols, Ultrasonic assisted extraction, Response surface method(RSM)

2016-11-09

2016-12-29

李芬芳(1991-)，女(汉)，河南洛阳人，硕士研究生，研究方向：生化分析

*通信作者：段云青，副教授，博士，硕士生导师。Tel:13934086398;E-mail: duan_yq@sina.com

山西农业大学引进人才基金项目(XB2009004)；江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(15)1021);句容市农业科技支撑计划项目(NY2016228842)

TS201.1

A

1671-8151(2017)03-0207-07