埋植褪黑激素对非繁殖季节和田羊胚胎移植效果的影响

石长青，侯 芳，王连群*，陈 荣，刘俊峰，王惠娥，王 永

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

埋植褪黑激素对非繁殖季节和田羊胚胎移植效果的影响

石长青1，2，侯 芳2，王连群1，2*，陈 荣1，2，刘俊峰1，2，王惠娥1，2，王 永1，2

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

为了探究外源性褪黑激素对非繁殖季节和田羊胚胎移植效果的影响，采取随机区组设计试验，选择30只和田羊成年母羊随机分为6组 （供体羊和受体羊各3组），5只和田羊成年公羊单独为1组做为配种公羊，分别给予3组供体羊和3组受体羊褪黑激素埋植、孕激素海绵栓结合促性腺激素、褪黑激素埋植结合孕激素海绵栓和促性腺激素处理。结果表明：褪黑激素埋植结合孕激素海绵栓和促性腺激素处理显著提高了非繁殖季节和田羊母羊的排卵率（P＞0.05），单纯埋植褪黑激素并未提高非繁殖季节和田羊母羊的排卵率。说明外源性的褪黑激素能够协同孕激素海绵栓和促性腺激素处理促进非繁殖季节和田羊母羊的排卵。

褪黑激素；埋植；非繁殖季节；和田羊；胚胎移植

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.01.007

现阶段，羊的同期发情及胚胎移植较为广泛使用的方法是孕酮阴道海绵栓结合马绒毛膜促性腺激素（eCG,equine chorionic gonadotropin）的处理方法[1]，其效果也得到了证实[2]。仅有少量的研究比较了褪黑激素与孕激素海绵栓结合促性腺激素对绵羊繁殖调控效果的影响[3]。本研究在非繁殖季节，对和田羊母羊进行褪黑激素埋植、孕激素海绵栓结合促性腺激素、褪黑激素埋植结合孕激素海绵栓和促性腺激素处理，以胚胎移植的方式，研究褪黑激素对母羊排卵率和受胎率的影响，比较三种诱导母羊繁殖方法的效果。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取2～3岁、体质健壮、体重一致、膘情适中、健康无病（无繁殖性疾病、遗传性疾病、传染性疾病）的空怀和田羊成年母羊30只。与配公羊选取2～3岁、体质强壮、精力旺盛、繁殖机能良好且有自然交配史的和田羊成年公羊5只。

1.2 主要药品器械

MLT埋植颗粒（10 mg/粒）、埋植器，促黄体生成素LH、促卵泡刺激素FSH、氯前列烯醇PG、阴道海绵栓（CIDR）、放栓器等，手术移植保定车、冲胚导管、移卵管、集卵杯、体视显微镜等。

1.3 试验设计

在非繁殖季节，采用单因素完全随机区组实验设计，将30只和田羊母羊随机分为6组（A组、B组、C组、D组、E组、F组），其中3组为供体羊组（A组、B组、C组），另外3组为受体羊（D组、E组、F组）。3组供体羊分别进行褪黑激素埋植处理（A组）、褪黑激素埋植结合孕激素海绵栓和促性腺激素处理（B组）、孕激素海绵栓结合促性腺激素处理（C组）；同样，相对应的3组受体羊也分别进行褪黑激素埋植处理（D组）、褪黑激素埋植结合孕激素海绵栓和促性腺激素处理（E组）、孕激素海绵栓结合促性腺激素处理（F组）。供体羊发情同期化和超排处理后，选择已埋植褪黑激素处理的公羊5只进行自然交配。配种后，进行胚胎移植，对两侧卵巢的黄体数目进行计数，并对胚胎质量进行观测。在供体羊胚胎移植至受体羊过程中，保持对应一致的同期化及超排方法，即：褪黑激素处理的供体羊的胚胎移植给褪黑激素处理的受体羊，褪黑激素埋植结合孕激素海绵栓和促性腺激素处理的供体羊的胚胎移植给褪黑激素埋植结合孕激素海绵栓和促性腺激素处理的受体羊，孕激素海绵栓结合促性腺激素处理的供体羊的胚胎移植给孕激素海绵栓结合促性腺激素处理的受体羊。胚胎移植完成后的35 d对受体羊进行孕检，确定移植后的存活胚胎数量。

1.4 试验处理

1.4.1 褪黑激素埋植

随机选择3组供体羊中的2组，于2014年6月1日在塔里木大学动科院综合试验站羊舍进行褪黑激素埋植，埋植剂量为20 mg/只，3组受体羊中的2组及5只公羊在同一时间也做相同的褪黑激素埋植处理。

根据预定的试验处理，由助手保定好羊只，实施褪黑激素埋植者剪掉公羊颈背部耳根处的羊毛，用75%的医用酒精消毒后，右手持装入预定剂量褪黑激素缓释剂的专用埋植器，左手提起公羊颈背部耳根处的皮肤呈空心三角形，将针头与埋植位点成30°角刺入皮下，拇指按压埋植器的活塞柄端，缓慢用力，由活塞推动埋植器中预定剂量的褪黑激素缓释剂注入颈背部耳根处，埋植完毕后迅速拔下埋植器及其针头，用医用酒精再次对埋植部位进行消毒。

1.4.2 同期化、超排、配种处理

2014年6月20日随机选择已经埋植褪黑激素2组供体羊中的1组进行CIDR+FSH+LH+PG的发情同期化和超数排卵处理，未进行褪黑激素埋植的供体羊组也进行相同的CIDR+FSH+LH+PG的发情同期化和超数排卵处理。随机选择已经埋植褪黑激素2组受体羊中的1组进行CIDR+PG的繁殖生理同期化处理，未进行褪黑激素埋植的受体羊组也进行相同的CIDR+PG的繁殖生理同期化处理。撤栓后，由公羊试情确定母羊发情，用埋植褪黑激素的和田羊公羊与供体和田羊母羊进行自然交配。具体胚胎移植程序见表1。

表1 供体羊和受体羊胚胎移植程序

1.4.3 胚胎移植

为了便于供体羊的胚胎采集和受体羊的胚胎移植，对所有母羊实施胚胎移植术前24 h断食和12 h断水处理，并将母羊乳房前腹中线手术部位的毛剪干净。

供体羊通过静松灵进行麻醉处理（防治麻醉过度），待羊只进入深度麻醉期后，置于手术台上保定好，并在术处放置好创巾并夹好。用手术刀沿着羊只躯体的纵轴方向在术部切开腹腔，并用止血钳止住出血较多的毛细血管，最后将子宫角和卵巢拉出，记录卵巢大小和黄体数目，用冲卵液通过三通式冲胚导管将胚胎从子宫冲进集卵杯中，置于体视显微镜下进行镜检，记录回收的胚胎数量及发育情况。

受体羊的术前处理、麻醉和开腹手术同供体羊，用移卵管将镜检优选的2枚优质胚胎移植到受体羊子宫角内（黄体发育较好侧），多余胚胎回收液氮冷冻保存。

采集胚胎结束后，立即用高压灭菌的生理盐水和青霉素对供体羊子宫冲洗干净，复位子宫和卵巢。涂抹碘酒于缝合切口及周围，并用纱布敷上青霉素粉末，立即对术羊进行80万IU青霉素和100万IU链霉素的肌注，并在其后的6 d内进行青霉素和链霉素的肌注，加强伤口及羊只的护理，防止创口感染。

1.4.4 孕检

在胚胎移植后的35 d，通过B超对受体羊进行孕检，记录受孕情况。

1.5 数据统计分析

用Excel对基础数据进行整理，用SPSS 22.0软件对整理后的数据进行统计分析，用卡方（X2）检验对百分数进行比较，用t检验对平均数进行比较。

2 结果与分析

从表2可以看出，B组供体羊黄体数显著高于A组和C组供体羊（P＜0.05），A组和C组供体羊黄体数之间差异不显著（P＞0.05）。虽然B组供体羊回收卵数和可用胚胎数均高于A组和C组供体羊，但是差异不显著（P＞0.05）。同样，供体羊的回收卵率和可用胚胎率在各处理组间均差异不显著（P＞0.05）。D组和E组受体羊的受胎率高于F组，但各组受体羊的受胎率差异不显著（P＞0.05）。

表2 埋植褪黑激素对和田羊母羊胚胎及受胎率的影响

3 讨 论

光周期通过调节褪黑激素的分泌进而调节性腺轴以实现对绵羊的繁殖季节的调控作用，因此人们很早就开始利用外源性褪黑激素提前季节性发情繁殖羊的繁殖[4]。但是，外源性褪黑激素对非繁殖季节羊的胚胎移植方面的研究和应用却很少。

3.1 外源性褪黑激素对绵羊胚胎的影响

本研究通过褪黑激素埋植结合孕激素海绵栓和促性腺激素处理提高了非繁殖季节和田羊母羊的排卵率。但是，与孕激素海绵栓结合促性腺激素处理比较，单纯埋植褪黑激素并未提高非繁殖季节和田羊母羊的排卵率。动物在繁殖季节具有较高的排卵率，而在非繁殖季节和繁殖季节的开始和结束排卵率较低。在休情期，孕酮会阻止LH峰，因而较早的终止了卵泡的发育和雌二醇的分泌[5]。通过褪黑激素埋植处理非繁殖季节的羊降低了雌激素对发情繁殖的负反馈调节效应，从而获得持续的LH脉冲和卵泡的充分发育生长[6]，Viguié等研究表明，通过外源性褪黑激素处理母羊74 d后能够显著增加母羊的GnRH和LH的脉冲[7]。本研究埋植褪黑激素可能通过降低雌激素对发情繁殖的负反馈调节效应和增加GnRH及LH的脉冲效应增加了孕激素海绵栓和促性腺激素处理的发情排卵效应。

关于单独使用外源性褪黑激素对于排卵率的影响仍然存在争议，有待于进一步研究。Zarazaga等[8]研究表明埋植褪黑激素能够增加排卵率，而对同期化母羊进行褪黑激素处理的相关研究认为：褪黑激素处理不是通过改变卵泡发生的周期而提高排卵率，而是通过减少中等大小和大的卵泡的闭锁增加了排卵卵泡的数量[9]。然而，也有研究得出了相反的结论，无论是在繁殖季节[10]还是在非繁殖季节[11]进行超数排卵时埋植褪黑激素均未明显诱导排卵率的增加，这可能是少数FSH注射程序利用了所有卵泡相对独立的闭锁机制[10]。类似，无论是繁殖季节还是非繁殖季节，从屠宰羊的卵巢上分离得到的卵母细胞的数量和体外培养（IVM）的成熟率上都没有差异[12]。Luther等研究表明非繁殖季节对母羊进行褪黑激素埋植没有增加卵母细胞的数量和体外培养成熟率[13]。Abecia等的研究表明褪黑激素对非繁殖季节或繁殖季节从绵羊的卵巢分离卵母细胞经体外成熟培养没有提高其成熟率[14]。Forcada等通过褪黑激素埋植结合孕激素海绵栓的方法使供体羊发情并通过公羊自然交配使之受孕，在发情配种后的7 d通过解剖采集胚胎，发现褪黑激素埋植（与对照组没有埋植褪黑激素比较）能够提高胚胎的质量[11]。

3.2 外源性褪黑激素对绵羊受胎率的影响

本研究表明，埋植褪黑激素具有增加非繁殖季节受体母羊受胎率的趋势，这一结果应归因于外源性的褪黑激素通过提高母羊黄体的功能或降低抗黄体溶解蛋白机制来提高胚胎的存活率，从而提高了受胎率。

反刍动物妊娠的开始和维持建立于胚胎对母体系统的信号，母体对妊娠的识别已经被限定为早期妊娠期黄体的退化被阻止的过程。反刍动物黄体溶解机制包括子宫内膜产生的PGF2α和催产素的反馈调节系统。雌二醇和孕酮是子宫功能的主要调节物，二者通过他们的分子受体调节黄体溶解的时间[16]。另外，褪黑激素影响黄体对孕酮的分泌已经在绵羊上得以报道[17]。有研究表明埋植褪黑激素进行发情繁殖同期化的处理方法提高了受胎率从而提高繁殖力[15]，这一作用应归因于黄体功能的提高[18]、排卵率的增加[19]和较高的胚胎存活率[17]。Chemineau等研究发现，非繁殖季节进行褪黑激素的处理能够通过提高黄体的功能或降低抗黄体溶解蛋白机制而提高胚胎的存活率来提高产羔率[15]。Abecia等给三个品种羊（Rasa Aragonesa,Assaf,Merino）在产羔季节开始时埋植MLT的研究进一步表明：埋植褪黑激素提高了非繁殖季节母羊超数排卵胚胎存活率，明显降低了不能够成活的胚胎细胞（退化的细胞和生长迟缓的细胞）的数量和比例[14]。Scott等研究表明，在配种后的45～90 d埋植缓释褪黑激素表明自然繁殖季节外源性的褪黑激素能够提高19%的窝产仔数[20]。Gómez等比较了埋植褪黑激素、孕激素海绵栓、埋植褪黑激素结合孕激素海绵栓这三种处理方法对乳用山羊产羔率的影响，结果表明这三种方法之间没有显著差异（P＞0.05）[2]。但是，McEvoy等的研究却得出了相反的结论：无论给母羊是否进行褪黑激素的处理，胚胎转移、胚胎生存均没有不同[10]。

本研究结果表明，褪黑激素埋植结合孕激素海绵栓和促性腺激素处理显著提高了非繁殖季节和田羊母羊的排卵率。

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Effects of Melatonin Implants on Embryo Transfer of Hetian Sheep during the Non-breeding Seasons

SHI Chang-qing1,2,HOU Fang2,WANG Lian-qun1,2*,CHEN Rong1,2,LIU Jun-feng1,2, WANG Hui-e1,2,WANG Yong1,2
（1.College of Animal Sciences,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China; 2.Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology,Xinjiang Production&Construction Corps,Alar Xinjiang 843300,China）

To explore the effect of exogenous melatonin on embryo transfer of Hetian Sheep during the nonbreeding seasons,taking a randomized block test，30 ewes and 5 rams were selected from Hetian sheep，5 rams separately asone breeding group，30 ewesdesigned averagely to six groupsrandomly,the estrus synchronization and superovulation of 3 group donors ewes and 3 grouprecipients ewes were administrated by melatonin implanted,progesterone sponge bolt combined with gonadotropins,melatonin implanted combined with progesterone sponge bolt and gonadotropins respectively.The results showed that the ovulation rate ofewes were increased significantly following melatonin implanted combined with progesterone sponge bolt and gonadotropins(P＞0.05)during the non-breeding seasons,the ovulation rate of ewes were not increasedonly following melatonin implanted during the non-breeding seasons.These results suggest that the ovulation of hetian sheep ewes were promoted by progesterone sponge suppository and gonadotropin treatment synergied exogenous melatonin during the non-breeding season.

melatonin;implants;non-breeding seasons;Hetian sheep;embryo transfer

S814.8

A

1003－6377（2017）01－0040-07

新疆生产建设兵团重点领域科技攻关项目“非繁殖季节和田羊繁殖效率关键技术的研究与应用”（2014BA010）

石长青（1970-），男，硕士，副教授，从事动物神经内分泌学研究。E-mail:scq926＠163.com

王连群（1977-），男，硕士，副教授，从事动物营养与饲料科学研究。E-mail:wlq2005199＠126.com

2016-11-20

2016-11-24