不同体型比格犬血清肿瘤标志物含量调查

刘宏，王森，黄凯，杨宗统，项路娟，王冬冬，刘永举，王建琳，尹燕博，

(1．青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109;2．青岛博隆实验动物有限公司，山东青岛266225;3．青岛农业大学生命科学学院，山东青岛266103)

不同体型比格犬血清肿瘤标志物含量调查

刘宏1，王森1，黄凯2，杨宗统1，项路娟2，王冬冬1，刘永举3，王建琳1，尹燕博1，2

(1．青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109;2．青岛博隆实验动物有限公司，山东青岛266225;3．青岛农业大学生命科学学院，山东青岛266103)

本试验拟对大、中、小体型3个品系的健康成年比格犬血清肿瘤标志物AFP、CEA、CA125、CA153、CA199进行检测，用犬肿瘤标志物AFP、CEA、CA125、CA153、CA199 ELISA试剂盒，对97只健康成年大体型比格犬、228只中体型比格犬、63只小体型比格犬的血清进行相关肿瘤标志物浓度测定，为比格犬肿瘤模型筛选提供参考。试验结果表明，小体型比格犬血清中AFP、CA125、CA153、CEA的浓度明显低于其他两个品系犬(P＜0．05);而CA199的浓度明显高于中体型比格犬(P＜0．05)。大体型比格犬血清中AFP、CEA、CA125、CA153的浓度最高，小体型比格犬血清中CA199最高，推测认为大体型比格犬患消化系统和生殖系统肿瘤的风险较高，小体型比格犬患腺癌的风险较高。

比格犬;血清;肿瘤标志物;ELISA

肿瘤是一类危害人类身体健康的疾病，尤其是恶性肿瘤，其高发病率和高死亡率严重威胁着人类生命安全及身心健康，肿瘤的防治是目前生物与医学领域的研究热点和难点。由于肿瘤发生机制非常复杂，受多因素影响，导致治疗时机把握与治疗效果不佳，故早期发现和早期诊断成为肿瘤的治疗的关键。

目前临床应用的X线检查、超声检查、CT检查、核磁共振检查、内腔镜检查等手段能从不同角度对肿瘤进行诊断，可在一定程度上提高肿瘤的早期诊断率，但又各有其局限性［1］。肿瘤标记物(tumor marker，TM)是在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是机体对肿瘤反应而异常产生和/或升高的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素酶、多胺及癌基因产物等［2］。肿瘤标志物特异性强，仅能在肿瘤组织细胞中产生，正常组织细胞中不存在，且肿瘤标志物敏感性高，仅有少量存在时即可被检测到，有助于肿瘤的筛选及早期诊断。临床上，以肿瘤标记物进行的诊断已经成为肿瘤患者的重要检查指标［3］。

在国内外的科研工作中，比格犬被广泛应用于医学、生物学、病理学、肿瘤学、免疫学、药理学、生物化学等生命科学领域［2］，用于人类相关疾病的发生机制、筛选治疗药物，是人类疾病研究最好的动物模型［4］。但在生理条件下，比格犬主要血清相关肿瘤标志物是否存在?不同品系之间是否相同?目前还未检索到相关文献报道。

本研究拟对不同体型品系健康比格犬的主要血清相关肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、乳腺癌标记物(CA153)、卵巢癌抗原(CA125)、胰腺癌敏感标记物(CA199)进行测定与比较，以丰富比格犬的生理学内容，并为不同肿瘤模型建立的比格犬选择奠定基础。

1 材料与方法

1．1 实验动物12月龄以上，大体型比格犬90只，体重18～23 kg;12月龄以上，中体型比格犬228只，体重13～17 kg;12月龄以上，自繁小体型比格犬64只，体重9～12 kg。此次实验用比格犬均由青岛博隆实验动物有限公司提供［SCXK(鲁)2012-0003］。

1．2 仪器与试剂电动台式离心机(80－2，上海梅香仪器有限公司);酶标仪(318C+，上海沛欧分析仪器有限公司);5种肿瘤标志物检测试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司。

1．3 方法每只比格犬前肢内侧静脉处采集血液2 mL，300 r/min×g离心5 min，取上清液待测。向96孔板中加入准备好的待测样品和标准品，37℃反应30 min;洗板5次，加入酶标试剂，37℃反应30 min;洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10 min;加入终止液，用酶标仪测定OD值，通过标准品制备曲线，计算待测样品浓度。

1．4 统计分析数据用GraphPad Prism Program 6 (GraphPad Software，San Diego，CA)软件进行统计，P＜0．05为差异显著。

2 结果

不同体型品系成年比格犬血清中都含有AFP、CEA、CA153、CA125、CA199，且这5种肿瘤标志物的浓度差别较大。不同体型品系比格犬间血清中AFP的含量主要集中到10～33 μg/L，不同品系之间差别较大，但大体型品系与中体型品系比格犬之间无统计学差异，而小体型品系与其他两种品系之间差异显著(P＜0．05)(见图1)。不同体型品系比格犬间血清中CEA的含量主要集中到10～21 μg/L，不同品系之间存在一定差别，但大体型品系与中体型品系比格犬之间无统计学差异，而小体型品系与其他两种品系之间差异显著(P＜0．05)(见图2)。

图1 不同体型成年比格犬血清AFP含量

图2 不同体型成年比格犬血清CEA含量

不同品系成年比格犬血清中CA153浓度大部分集中到3～9 U/L之间，且大体型品系与中体型品系之间的CA153含量相似，而小体型与大体型、中体型比格犬血清中CA153浓度有显著性差异(P＜0．05)(见图3)。不同品系成年比格犬血清中CA125浓度大部分集中到6～21 U/L之间，且大体型品系与中体型品系比格犬之间无明显差别，小体型与大体型、中体型比格犬血清中CA125浓度有显著性差异(P＜0．05)(见图4)。不同品系成年比格犬血清中CA199浓度大部分集中到7～16 U/L之间，且大体型品系与中体型品系和小体型品系之间无明显差别(P＞0．07)，而小体型品系成年比格犬血清中CA199的含量显著高于中体型品系成年比格犬(P＜0．05)(见图5)。

图3 不同体型成年比格犬血清CA153含量

图4 不同体型成年比格犬血清CA125含量

图5 不同体型成年比格犬血清CA199含量

3 讨论

自20世纪80年代以来，各种肿瘤标志物相继在临床应用于肿瘤的诊断，肿瘤标志物的检出具有高效、方便、标本易获取等优点，同时也为组织学分型、临床分期、预后判断和疗效检测等提供重要的应用价值［5］。比格犬作为重要的人类肿瘤研究的重要模型，已有报道人工诱发比格犬肺癌、肝癌、骨癌和乳腺癌等用于人类肿瘤模型的研究［6－7］，且也有比格犬患乳腺癌［8］等肿瘤疾病的研究报道，且大部分的研究报道主要集中到肿瘤的发生机制和临床病例方面，而无生理状态下肿瘤标志物检测的相关报道。

肿瘤标志物最重要的价值是能明确手术、放疗和药物治疗是否有效，有的还可反映肿瘤残留量，故检测肿瘤标志物的浓度可为临床提供重要的信息。不同类型肿瘤具有不同的肿瘤表面标志物质，目前常见的血清肿瘤标记物主要包括AFP、CEA、CA153、CA125、CA199等。AFP是有胚肝细胞核卵黄囊产生的甲胎蛋白，在发生肝细胞癌、卵黄囊和胚胎性肿瘤时其血清浓度升高，是目前为止诊断原发性肝癌最敏感的标志物［9］。CEA为基因编码于19号染色体上的具有人类抗原决定簇的酸性糖蛋白，为胚胎性致癌抗原，于1965年发现，被认为是结肠癌的标志物［10－11］，但是后来被认为在各种消化道肿瘤均有所表达。单项肿瘤标记物的检测可能会造成肿瘤的漏诊或误诊，多种标记物联合检测可提高肿瘤的检出率。研究认为AFP和CEA联合诊断原发性肝癌的阳性率和特异性明显高于单独检测AFP。本研究中，不同体型品系成年比格犬血清中AFP和CEA都具有明显的差别，但二者在不同品系比格犬种变化相似，且大体型品系犬最高，而小体型品系犬的浓度明显低于其他品系犬。这表明，AFP和CEA的浓度可作为肝癌和(或)结肠癌的重要标志物质，在大体型比格犬中浓度最高，表明该品系犬对消化系统肿瘤较为敏感，可作为消化系统肿瘤研究的模型动物。

CA125最初从上皮性卵巢癌检测出的一种糖蛋白，主要应用于卵巢癌的诊断和随访，其他恶性肿瘤患者血清CA125的水平也会升高，其他疾病如炎症、肝硬化等非恶性肿瘤时，CA125可有不同程度的升高，但一般低于正常值［12］。CA153是乳腺癌的特异性指标，其浓度增高提示患有乳腺癌、肺癌、肾癌、消化道肿瘤、评巢癌的可能性，其水平变化与乳腺癌诊断、复发相关［13］。本研究中不同体型品系成年比格犬血清中AFP和CEA都具有一定的差别，其中大体型品系和中体型品系犬相似，而在小体型品系犬中的含量明显低于其他品系。这表明，CA125和CA153的浓度可作为卵巢癌和乳腺癌等生殖系统肿瘤的重要标志物质，在大、中体型比格犬中浓度较高，而小体型品系犬中最低，表明小体型品系犬对生殖系统肿瘤较不敏感，不建议作为生殖系统肿瘤研究的模型动物。

CA199是由Koprowski于1979年用结肠癌细胞株SW1116免疫BALB/c小鼠而得到的一株肿瘤特异性单克隆116－NS199。正常人血清中含量极微，当患者肝、胆、胰等疾病时即会出现含量升高，它对肿瘤的疗效观察、预后判断、复发和转移均有十分重要的临床价值。1983年Del Villano等首先描述了血清CA199对胰腺癌的诊断意义，CA199为与腺癌高度相关的物质，由腺癌细胞产生，胰腺癌、胃癌伴转移过程中CA199明显升高［9］。本研究中不同体型品系成年比格犬血清中CA199都具有一定的差别，其中在中体型品系含量最低，而在小体型品系犬中的含量最高，且明显高于中体型品系犬。这表明，CA199的浓度可作为腺癌，尤其是胰腺癌的重要标志物质，在大、中体型比格犬中浓度较低，而小体型品系犬中最高，表明小体型品系犬对胰腺癌等腺癌相关肿瘤的发生较敏感，可作为腺癌肿瘤研究的模型动物。

综上研究结果表明，不同体型品系成年比格犬血清肿瘤标志物AFP、CEA、CA125、CA153、CA199的浓度存在一定差异，大体型品系比格犬肿瘤标记物较高可作为多种肿瘤模型的研究，这为筛选比格犬品系作为肿瘤研究提供了重要的基础，同时对比格犬作为实验动物的品系繁育具有重要的指导意义。

［1］李策，聂彩辉，张力君，等．肿瘤标志物的应用及其筛选技术研究进展［J］．药学进展，2014，38(1):1-13．

［2］靳晓亮，杨波，关方霞，等．肿瘤与肿瘤标志物研究中证据的思考［J］．医学与哲学，2009，30(2):48-50．

［3］时广利，胡秀玲，岳思东，等．血清肿瘤标志物在肺癌辅助诊断中的应用［J］．中华肿瘤杂志，2005，27(5):299-301．

［4］宋洁，曹燕，黄茜．国内比格犬的生物学指标研究及相关应用进展［J］．医学动物防制，2012，28(6):650-652．

［5］Hatzakis K D，Fmudarakis M E，Bouros D，et al．Prognostic value of serum tumor markers in patients with lung cancer［J］．Respiration，2002，69:9-25．

［6］Wilson D A，Mohr L C，Frey G D，et al．Lung，liver and bone cancer mortality after plutonium in beagle dogs and nuclear workers［J］．Health Phys，2010，98(1):42-52．

［7］Wilson D A，Diel J H，Hoel D G．Lung fibrosis and lung cancer incidence in beagle dogs that inhaled 238PuO2 or 239PuO2［J］．Health Phys，2009，96(4):493-503．

［8］Kwapien R P，Giles R C，Geil R G，et al．Malignant mammary tumors in beagle dogs dosed with investigational oral contraceptive steroids［J］．J Natl Cancer Inst，1980，65(1):137-144．

［9］汤钦枞，魏祥坤．血清AFP、CEA、CA125、CA199在原发性肝癌的诊断中的应用价值［J］．海南医学院学报，2009，15(11): 1395-1397．

［10］Gold P，Freedom S O．Demonstration of tumor specific antigens in human colonic carcinoma by immunological tolerance and absorption techniques［J］．EXP med，1965，121:439-462．

［11］Juntermanns B，Radunz S，Heuer M，et al．Tumor markers as a diagnostic key for hilar cholangiocarcinoma［J］．Eur J Med Res，2010，15(8):357-361．

［12］王海燕，朱正学，肖燕，等．非小细胞肺癌血清中CA125、CEA的浓度及意义［J］．中国肺癌杂志，2008，11(1):97-100．

［13］田满福，韩波．检测CA199、CA125、CA153及CEA在肿瘤诊断中的意义［J］．临床和实验医学杂志，2010，9(7):483-485．

［14］吴荣芳．联合检测胆汁中CEA、CA19－9、CA72－4对胆管癌的诊断价值［D］．泰安:泰山医学院，2011．

S858.292

B

0529-6005(2017)01-0075-03

2016-01-18

“十二五”农村领域国家高技术研究发展计划(863计划)(2012AA101303)

刘宏(1988-)，女，硕士，主要从事预防兽医学研究，Email:liuhong_22188@163．com

王建琳，Email:bjsxxw@126．com;尹燕博，Email: yanboyin2011@163．com