CpG ODN联合重组乳酸乳球菌鼻内免疫BALB/c小鼠的佐剂效应

王振华，曾宪垠

(1．成都农业科技职业学院，四川温江611130; 2．四川农业大学生命理学院原子能应用实验室，四川雅安625014)

CpG ODN联合重组乳酸乳球菌鼻内免疫BALB/c小鼠的佐剂效应

王振华1，曾宪垠2

(1．成都农业科技职业学院，四川温江611130; 2．四川农业大学生命理学院原子能应用实验室，四川雅安625014)

本试验初次建立了CpG ODN联合重组乳酸乳球菌滴鼻免疫BALB/c小鼠模型。结果得出CpG ODN佐剂协同重组菌抗原组血清中抗PRRSV特异性抗体IgG和呼吸道黏膜抗体s-IgA均高于单独重组菌组(P＞0．05)和单独佐剂组(P＜0．01)，佐剂CpG ODN协同重组菌抗原组的Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ及黏膜淋巴因子IL-5的活性高于单独抗原组(P＞0．05)及单独佐剂组(P＜0．01)。试验结果说明CpG ODN作为佐剂与重组菌鼻腔免疫小鼠后，可以提高重组菌诱导的黏膜免疫反应和Th1细胞参与的系统免疫反应，为研究安全有效的重组菌黏膜疫苗奠定了基础。

CpG ODN;重组乳酸乳球菌;鼻腔免疫

随着免疫学的深入发展，黏膜免疫以其独特的优势在抵抗感染方面占有重要地位，在进行疫苗研究时，新型佐剂的作用也受到更多重视，比较理想的黏膜佐剂应高效、安全，能激活黏膜免疫系统，在其存在的情况下抗原经黏膜供给可引发抗原特异性系统免疫和黏膜免疫应答，同时能避免黏膜免疫耐受的产生。CpG ODN(CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN)是人工合成的含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸，模拟了细菌DNA结构，可激活T细胞、B细胞、NK细胞等，产生大量的多种细胞因子，与抗原蛋白共同免疫，具有较强的佐剂效应，能同时增强抗原特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，尤其是对细胞免疫应答具有更突出的增强作用。目前研究资料显示，CpG ODN经鼻腔免疫接种小鼠是一种有效的黏膜佐剂，既能增强黏膜抗原黏膜免疫应答，又可以增强系统免疫应答(包括体液免疫和细胞免疫)的功能，促进Thl/Th2型免疫反应，另外临床实验还证明了CpG ODN对于人类具有安全性［1－5］。

本试验初次建立了CpG ODN联合重组乳酸乳球菌滴鼻免疫BALB/c小鼠模型，评价其佐剂效应。

1 试验材料

1．1 实验动物BALB/c小鼠，雌性，体重18～22 g，6～8周龄，购自华西试验动物中心。

1．2 佐剂及免疫原佐剂:CpG ODN(5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

免疫原:重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900－M/PRRS(本实验室构建并保存)，菌株为乳酸乳球菌NZ3900，表达载体为pNZ8149，表达蛋白为猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF6基因片段(即M蛋白)。

1．3 主要试剂HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗鼠IgA，购自美国Sigma公司;细胞因子检测试剂盒为基因美公司产品。

2 试验方法

2．1 实验动物的选取及处理试验将BALB/c小鼠90只随机分为3组(n=30)，分别为重组菌对照组(组Ⅰ)、佐剂+重组菌试验组(组Ⅱ)和佐剂对照组(组Ⅲ)具体见表1。各组实验动物被连续免疫三次，间隔7天，每次连续免疫三天(即:1 d，2 d，3 d，11 d，12 d，13 d，21 d，22 d，23 d)［6］。

表1 实验动物分组及处理

2．2 免疫用免疫原的制备将重组菌PNZ8149/ NZ3900－M/PRRS诱导后离心收集菌体，用0.01 mol/L无菌PBS洗涤悬浮，使细菌含量为1×1011CFU/mL，并将重组菌PNZ8149/NZ3900－M/PRRS与免疫佐剂充分乳化，佐剂剂量为10 μg/只。

2．3 样品采集及指标检测

2．3．1 呼吸道黏膜s-IgA检测分别于最后一次免疫后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d处死小鼠6只，取肺脏，收集冲洗液，采用间接ELISA方法检测呼吸道黏膜s-IgA水平。

2．3．2 血清中特异抗体IgG检测分别于最后一次免疫后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d眼眶静脉采集6只小鼠血液，收集血清，采用间接ELISA方法检测血清特异性抗体。

2．3．3 细胞因子检测分别于最后一次免疫后14 d，处死后取鼠脾脏，制备脾脏淋巴细胞悬液，收集脾脏淋巴细胞培养上清液，用ELISA试剂盒检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ的活性。

3 结果分析

3．1 血清IgG抗体由表2得出，佐剂+重组菌小鼠血清中特异性IgG抗体含量高于重组菌对照组(P＞0．05)，及佐剂对照组组(P＜0．01)。结果表明，佐剂CpG ODN通过鼻腔免疫可以增加重组乳酸乳球菌体液免疫水平。

3．2 呼吸道黏膜s-IgA由表3可出，在整个免疫测定时间内，佐剂+重组菌组小鼠呼吸道黏膜中s-IgA含量高于单独佐剂组(P＜0．01)和单独重组菌组(P＞0．05)。同时所有组小鼠黏膜中的特异性s-IgA都处于平稳状态，可能是检测时间比较晚或检测周期相对较短导致。表明黏膜免疫佐剂CpG ODN经鼻腔免疫接种可以提高重组菌刺激呼吸道黏膜产生s-IgA的含量。

3．3 细胞因子佐剂CpG ODN联合重组菌PNZ8149/NZ3900－M/PRRS鼻内免疫小鼠后，小鼠脾脏细胞悬液中Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ和黏膜淋巴因子IL-5的活性高于重组菌PNZ8149/ NZ3900－M/PRRS单独免疫组(P＞0．05);Th2型细胞因子IL-4水平在各组之间差异不显著(P＞0.05)(见表4)。结果表明，佐剂CpG ODN通过鼻腔免疫能够提高重组菌的抗原应答。

4 讨论

佐剂CpG ODN是一种有效的黏膜佐剂，经鼻腔免疫接种小鼠既能增强黏膜抗原黏膜免疫应答，又可以增强系统免疫应答(包括体液免疫和细胞免疫)的功能，促进Thl/Th2型免疫反应［1－5］。1998年，Moldoveanu等以CpG佐剂协同灭活流感病毒抗原滴鼻免疫小鼠，测得血清中IgG和鼻腔、生殖道黏膜中s-IgA的滴度比单独抗原组显著增高，首次证明CpG具有黏膜佐剂作用;Kodama等以CpG ODN为佐剂，与抗原P6联合鼻内免疫小鼠，结果血清和鼻腔冲洗液中均检出高滴度的IgG和s-IgA［7］;史彤等以幽门螺杆菌超声粉碎物作为抗原，以CpG ODN作为佐剂，得出CpG ODN作为鼻黏膜免疫佐剂激活Thl型免疫应答和IFN-γ的分泌在抗感染中起着重要作用［8］。石蓉等将弓形虫可溶性速殖子抗原(STAg)与不同剂量(1 μg、5 μg、10 μg)的CpG ODN联合滴鼻免疫小鼠，得出CpG ODN可作为STAg的鼻腔免疫的黏膜佐剂［9］;张晓文等在H5N2型禽流感灭活抗原中添加佐剂CpG ODN，证实CpG ODN佐剂能够增加罗曼公鸡呼吸道s-IgA分泌细胞面积和IgG分泌细胞数量，提高局部呼吸道体液免疫应答水平［10］。Kumar等评价了CpG ODN佐剂对鼠源疟原虫19 kD膜表面蛋白表达抗原的免疫增强作用，结果显示CpG ODN主要产生Thl型免疫反应［11］。本研究在目前的研究基础上，采用10 μg的CpG ODN作为佐剂，以重组菌PNZ8149/NZ3900－M/ PRRS为抗原，鼻腔免疫小鼠，佐剂CpG ODN协同重组菌经鼻腔免疫小鼠能提高抗原诱导的黏膜免疫和h1型细胞介导的特异性免疫反应，为黏膜免疫的广泛应用提供了良好基础。

表2 佐剂CpG ODN联合重组菌鼻内免疫小鼠后血清中特异性IgG检测结果

表2 佐剂CpG ODN联合重组菌鼻内免疫小鼠后血清中特异性IgG检测结果

注:同列肩标不同字母表示组间差异显著(P＜0．05)，相同字母表示组间差异不显著(P＞0．05);大写字母表示(P＜0．01)水平，小写字母表示(P＜0．05)水平，下表同

表3 佐剂CpG ODN联合重组菌鼻内免疫小鼠后呼吸道黏膜特异性s-IgA检测结果

表3 佐剂CpG ODN联合重组菌鼻内免疫小鼠后呼吸道黏膜特异性s-IgA检测结果

?

表4 佐剂CpG ODN联合重组菌鼻内免疫小鼠脾细胞悬液分泌的细胞因子检测结果

表4 佐剂CpG ODN联合重组菌鼻内免疫小鼠脾细胞悬液分泌的细胞因子检测结果

?

5 结论

CpG ODN佐剂协同重组乳酸乳球菌鼻腔免疫小鼠后，具有明显的黏膜佐剂的效应，由此表明，CpG ODN作为重组乳酸乳球菌疫苗免疫佐剂的有效性，为病原体疫苗提供了新的免疫策略。

［1］McCluskie M J，Weeratna R D，Davis H L．Intranasal immunization of mice with CpG DNA induces strong systemic and mucosal responses that are influenced by other mucosal adjuvants and antigen distribution［J］．Molecular Medicine，2000，6(10):867-877．

［2］McCluskie M J，Weeratna R D，Clements J D，et al．Mucosal immunization of mice using CpG DNA and/or mutants of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli as adjuvants［J］，Vaccine，2001，19(27):3759-3768．

［3］McCluskie M J，Weeratna R D，Payette P J，et al．Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategies in mice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA［J］．FEMS Immunology＆Medical Microbiology，2002，32(3):179-185．

［4］McCluskie M J，Davis H L．Oral intrarectal and intranasal immunizations using CpG and non-CpG oligodeoxynucleotides as adjuvants［J］．Vaccine，2000，19(4-5):413-422．

［5］Zhang L，Tian X，Zhou F．Intranasal administration of CpG oligonucleotides induces mucosal and systemic Type 1 immune responses and adjuvant activity to porcine reproductive and respiratory syndrome killed virus vaccine in piglets in vivo［J］．International immunopharmacology，2007，7(13):1732-1740．

［6］Quigley B R，Hatkoff M，Thanassi D G，et al．A foreign protein incorporated on the Tip of T3 pili in Lactococcus lactis elicits systemic and mucosal immunity［J］．Infection and immunity，2010，78(3):1294-1303．

［7］Kodama S，Abe N，Hirano T，et al．Safety and efficacy of nasal application of CpG oligodeoxynucleotide as a mucosal adjuvant［J］．The Laryngoscope，2006，116(2):331-335．

［8］史彤，刘文忠，萧树东．CpG寡核苷酸可作为幽门螺杆菌疫苗的佐剂［J］．中华消化杂志，2003，23(4):233-236．

［9］石蓉，殷国荣，管志玉，等．不同剂量CpG ODN联合STAg鼻内免疫BALB/c小鼠诱导的免疫应答［J］．世界感染杂志，2006，6(2):118-121．

［10］张晓文，杨倩．禽流感灭活抗原与佐剂配合鼻腔免疫对鸡呼吸道抗体分泌细胞的影响［J］．南京农业大学学报，2007，30(1):94-98．

［11］Kumar S，Jones T R，Oakley M S，et al．CpG oligodeoxynucleotide and Montanide ISA 51 adjuvant combination enhanced the protective efficacy of a subunit malaria vaccine［J］．Infection and immunity，2004，72(2):949-957．

The Adjuvant CpG ODN Enhance the Recombinant Lactococcus lactis Antigen Elicited Mucosal and Systemic Immunity in Mice by Intranasal Immunization

WANG Zhen-hua1，ZENG Xian-yin2
(1．Department of Animal and Veterinary Science，Chengdu Vocational College of Agricultural Science and Technology，Wenjiang 611130，China;2．Isotope Research Laboratory，College of Life and Basic Sciences，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)

In order to evaluate the effect of CpG ODN adjuvant，we investigated whether co－administration intranasally of the antigen of the recombinant Lactococcus lactis(L．1actis)expressing ORF6 gene of PRRSV and the adjuvant CpG ODN can enhance mucosal and systemic immune responses in mice．The results showed that the level of mucosal s－IgA in lung lavage fluid and IgG in serum of the mice immunized with the recombinant L．1actis plus adjuvant CpG ODN significantly increased compared with the control group immunized with the recombinant L．1actis plus(P＞0．05)and adjuvant CpG ODN alone(P＜0．01)．Interestingly，The activity of Th1－type cytokines IL-2，IFN-γ and mucosal lymphokine IL-5 in splenocytes were higher than those of the control group immunized with the recombinant L．1actis plus(P＞0．05)and adjuvant CpG ODN alone(P＜0．01)．Taken together，the results demonstrate that intranasal delivery of CpG ODN as a mucosal adjuvant can enhance the antigen－specific mucosal and Th1－typ systemic immune response．

CpG oligodeoxynucleotide;recombinant Lactococcus lactis;Intranasal immunization

ZENG Xian-yin

P392

A

:0529-6005(2017)01-0034-03

2015-08-31

王振华(1975-)，女，博士，副教授，主要从事动物微生态学及动物疫病防控的研究，E-mail:363150834@qq．com

曾宪垠，E-mail:616920885@qq．com