四神丸对脾肾阳虚泄泻大鼠胃肠运动及Ghrelin的影响

李霞，刘富林，卿龙丽，邓娜，蔺晓源

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208;2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007; 3.湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208)

实验研究

四神丸对脾肾阳虚泄泻大鼠胃肠运动及Ghrelin的影响

李霞1，刘富林1，卿龙丽1，邓娜1，蔺晓源2，3*

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208;2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007; 3.湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208)

目的:观察四神丸对脾肾阳虚型泄泻模型大鼠胃肠运动及Ghrelin的影响。方法:将72只SPF级SD大鼠随机分为正常组、模型组、得舒特、四神丸高、中、低剂量组，每组12只。除正常组外，其余各组均采用灌服腺嘌呤和番泻叶水煎剂复制脾肾阳虚型泄泻大鼠模型。给药14 d后观察各组大鼠一般状态、腹泻指数、胃肠运动及血清Ghrelin含量变化。结果:模型组大鼠一般状态虽有所改善但腹泻仍持续存在，且胃残留率、小肠推进率及血清Ghrelin含量与正常组比较均有显著性差异(P＜0.01)。四神丸各剂量组、得舒特组上述指标均较模型组有所改善(P＜0.05或P＜0.01)。且四神丸高剂量组胃内残留率和小肠推进率明显优于其他各给药组(P＜0.05)，四神丸高剂量组血清Ghrelin含量明显优于中、低剂量组(P＜0.05)。而四神丸中、低剂量组的胃内残留率和小肠推进率、以及高、中剂量组血清Ghrelin含量与得舒特组比较差异均不显著(P＞0.05)。结论:四神丸能有效缓解脾肾阳虚泄泻大鼠症状，以高剂量组效果为佳，其作用机制可能与调节胃肠运动及血清Ghrelin水平有关。

四神丸;泄泻;脾肾阳虚;胃排空;肠推进;Ghrelin

腹泻型肠易激综合征(Irritable bowel syndrome with diarrhea，IBS-D)是最常见的功能性胃肠病之一，临床以腹泻、腹痛为主要症状，可持续或间歇发作［1］，属于中医“泄泻”的范畴。而基于“脾肾相关”理论的四神丸是临床治疗脾肾阳虚泄泻之名方，但其作用机制未明。胃促生长素(Ghrelin)是基于脑肠互动调节胃肠运动的重要脑肠肽之一。因此，本实验采用病证结合的动物模型，观察了四神丸对脾肾阳虚泄泻大鼠胃肠运动及血清Ghrelin含量的影响，现将结果报告如下。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级大鼠SD大鼠72只，雄性，体质量(200±20)g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号:SCXK(相)2013-0004。

1.2 实验药物

四神丸(北京同仁堂天然药物(唐山)有限公司，批号14080012，规格:27 g/瓶)，研碎后过筛，用蒸馏水配制、浓缩成0.732 g/mL、0.366 g/mL、0.183 g/mL的混悬液放入4℃冰箱备用。得舒特(匹维溴铵片，法国苏威制药公司，规格:50 mg/片)，研碎后过筛，配制成1.523 mg/mL的药液备用。腺嘌呤(Solarbio，Lot.No.617D051，规格:10 g/瓶)，配制成0.02 g/mL的悬浊液。番泻叶(购于老百姓大药房，符合《中国药典》标准)，冷水浸1 h后加水煮沸约10 min，过滤浓缩成1.0 g/mL的药液。

1.3 主要试剂与仪器

［2］制备营养性半固体糊，密度为1 g/mL，冰箱冷藏，用时恢复至室温。大鼠 Ghrelin ELISA试剂盒(美国RD公司);Enspire多功能酶标仪(美国Perkinelmer);Lynx6000落地式高速离心机(美国ThermoFisher);AUW120D精密电子天平(日本岛津)。

2 方法

2.1 动物造模

参考文献［3-6］造模，每只大鼠给予0.2 g/kg的腺嘌呤灌胃4周;并单日、双日交替喂养甘蓝(10 g/只)和精炼猪油(2 mL/只)，从第3周起再灌服冰番泻叶水浸剂(10 mL/kg)2周。

2.2 分组与给药

所有动物适应性喂养1周后，先根据体质量用Excel表随机数字法取12只作为正常组，不予造模，其余60只造模后再随机分为模型组、得舒特组、四神丸高、中、低剂量组，每组12只。四神丸高、中、低剂量组动物每日按7.32 g/kg、3.66 g/kg、1.83 g/kg灌胃(分别相当于成人等效剂量的4、2、1倍)，模型组给予等容量蒸馏水，得舒特组按15.23 mg/kg给予得舒特水溶液，正常组常规喂养。给药14天。

2.3 指标检测

2.3.1 一般状态

给药期间观察各大鼠的精神、活动、毛发、饮食量、体质量、二便等一般状态。

2.3.2 腹泻指数

记录给药前后各组大鼠排稀便数量、次数、粪便直径等腹泻情况，并计算腹泻指数。腹泻指数=稀便率×平均稀便级。稀便率指每只大鼠所排稀便数与总便数之比;稀便级是以稀便污染滤纸形成污迹面积的大小分4级，标准如下:污迹直径＜1 cm为l级，1～2 cm为2级，2～3 cm为3级，＞3 cm为4级。

平均稀便级=稀便级数总和/稀便次数［4］

2.3.3 胃肠运动检测

给药第13 d，各组大鼠禁食(自由饮水)24 h后末次给药，给药后1 h灌胃给予半固体糊(2 mL/只)，15 min后10%水合氯醛麻醉，心脏采血后迅速打开腹腔，并用细线结扎胃幽门和贲门，然后取出胃和小肠(上端至幽门，下端至回盲部)。胃用滤纸擦干后称得胃全重，然后沿胃大弯侧剪开胃体，洗去胃内容物后擦干称重得胃净重，然后计算胃残留率。胃残留率(%)=(胃全重-胃净重)/灌胃量×100%。测自幽门至碳末推进最前端的距离(推进长度)及幽门至盲肠根部的总距离(总长度)，并计算小肠推进率。小肠推进率(%)=(推进长度/总长度)×100%［7］。

2.3.4 血清Ghrelin含量检测

大鼠麻醉后心脏采血，4℃ 离心(3 000 rpm) 15 min，取上层血清置于-20℃冰箱保存待测。采用ELISA法检测血清Ghrelin含量。

2.4 统计学处理

所有数据采用SPSS19.0统计学软件进行处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法。

3 结果

3.1 各组大鼠一般状态变化

正常组大鼠精神状态佳，活动迅速、反应灵敏、毛发光泽，饮食饮水、二便正常，体质量也保持一定的增长。造模组大鼠从造模第2周起出现精神不振、反应迟钝、活动也明显减少、毛发逐渐枯萎、大便稀软、小便量增加，体质量下降;第3周起饮食减少、爪甲色淡、倦怠嗜卧、蜷缩喜扎堆、尾巴变凉、大便稀溏甚者有水样便，且大便次数增多、肛周污秽、体质量下降明显。给药后模型组大鼠上述部分症状虽然有轻微好转，但大便清稀一直存在;另外该组1只大鼠因极度消瘦死亡。四神丸高、中、低剂量组和得舒特组大鼠给药l周后，上述症状均有不同程度的缓解，主要表现在活动和饮食增多，粪便次数减少且成形;四神丸高、低剂量组和得舒特组均有1只大鼠因灌胃不当死亡。

3.2 各组大鼠腹泻指数变化

给药前四神丸高、中、低剂量组、得舒特组与模型组的腹泻指数比较差异不显著(P＞0.05)。给药后四神丸高、中、低剂量组和得舒特组的腹泻指数均明显低于模型组(P＜0.05)，其中又以四神丸高剂量腹泻指数下降最为明显(P＜0.01)。见表1。

3.3 各组大鼠胃肠运功变化

与正常组比较，模型组大鼠胃残留率降低、小肠推进率升高，差异均有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，四神丸各剂量组和得舒特组均可不同程度的抑制大鼠胃排空及小肠推进(P＜0.05或P＜0.01)，且四神丸高剂量组明显优于其他各给药组(P＜0.05)，而四神丸中、低剂量组与得舒特组比较差异不显著(P＞0.05)。见表2。

表1 各组大鼠腹泻指数比较(±s)

表1 各组大鼠腹泻指数比较(±s)

注:与模型组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01。

组别 n 给药前 给药后正常组12 0 0模型组 11 1.34±0.18 1.31±0.11得舒特组 11 1.33±0.14 1.03±0.13△四神丸低剂量组 11 1.34±0.11 0.98±0.17△四神丸中剂量组 12 1.35±0.15 0.96±0.18△四神丸高剂量组 11 1.33±0.13 0.94±0.12▲

表2 各组大鼠胃残留率和小肠推进率比较(±s，%)

表2 各组大鼠胃残留率和小肠推进率比较(±s，%)

注:与正常组比较，☆P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01;与四神丸高剂量组比较，#P＜0.05。

组别 n 胃残留率 小肠推进率正常组12 45.36±7.44 57.35±8.02模型组 11 25.89±5.14☆75.89±11.87☆得舒特组 11 34.43±5.13△#65.57±9.21△#四神丸低剂量组 11 30.37±4.64△#69.26±10.26△#四神丸中剂量组 12 35.06±6.09△#64.32±8.07△#四神丸高剂量组 11 47.27±8.56▲55.62±7.23▲

3.4 各组大鼠血清Ghrelin含量变化

与正常组比较，模型组 Ghrelin含量显著增高(P＜0.01);各给药组 Ghrelin含量均较模型组降低(P＜0.05或P＜0.01);四神丸高剂量组明显优于中、低剂量组(P＜0.05)，四神丸低剂量组与得舒特组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而四神丸高、中剂量组与得舒特组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清Ghrelin含量比较(±s，pg/mL)

表3 各组大鼠血清Ghrelin含量比较(±s，pg/mL)

注:与正常组比较，#P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01;与四神丸高剂量组比较，*P＜0.05;与得舒特组比较，☆P＜0.05。

组别n Ghrelin正常组12 1139.64±270.76模型组 11 1668.42±233.59#得舒特组 11 1323.67±275.28△四神丸低剂量组 11 1455.21±232.37△＊☆四神丸中剂量组 12 1361.52±259.13△＊四神丸高剂量组 11 1236.18±261.09▲

4 讨论

泄泻病位在肠，脾失健运是其关键，同时与肾脏密切相关。如《景岳全书》所言:“肾为胃关，开窍于二阴，……今肾中阳气不足，则命门火衰……即令人洞泄不止也”。遵益火补土法，治当温肾健脾。脾和肾是中医藏象学说中非常重要的两个脏器，是中医先后天之本的精髓。脾为后天之本，肾为先天之本，二者在生理病理上均密切相关。在生理上，脾肾相互依存、相互制约;在病理上，脾病及肾、肾病及脾、脾肾同病。有研究表明［8］，脾肾相关的病理证候是脾肾阳虚证，而四神丸则是治疗脾肾阳虚泄泻的经典方，临床用于治疗IBS-D效果显著［9］。我们前期研究发现，四神丸汤剂对脾肾阳虚泄泻模型大鼠的作用可能与调节细胞因子TNF-α、IL-2、IL-4和外周血T细胞亚群水平有关［10-11］。

Ghrelin作为最常见的脑肠肽之一，是日本科学家Kojima等首先在大鼠胃黏膜及下丘脑发现的一种脑肠肽，由28个氨基酸组成，是迄今发现的唯一生长激素释放激素受体的内源性配体。Ghrelin及其受体主要在胃、肠道、下丘脑和垂体分布。目前已有大量文献证明Ghrelin在消化系统生理病理机制中占有重要地位［12-13］。研究表明，Ghrelin的结构与功能与胃动素具有相关性，有促进胃肠蠕动的作用［7］。我们的前期研究也发现，胃肠运动功能障碍小鼠血清Ghrelin水平降低［14］。同时，通过临床观察我们也发现功能性消化不良特别是餐后不适综合征患者血浆Ghrelin水平与患者临床症状轻重呈负相关［15］。

本实验中，模型组大鼠一般状态虽有所改善但腹泻仍持续存在，而胃残留率的降低、小肠推进率的升高，以及血清Ghrelin含量的增加，均提示模型大鼠胃肠动力出现亢进状态。经用药后四神丸各剂量组上述指标均较模型组有所改善(P＜0.05或P＜0.01)，说明四神丸作用于模型大鼠效果明确。而四神丸高剂量组为胃肠运动和血清Ghrelin水平的调节明显优于中、低剂量组(P＜0.05)，表明四神丸具有一定的剂量依赖性，以高剂量效果为佳。但四神丸中、低剂量组的胃内残留率和小肠推进率、以及高、中剂量组血清Ghrelin含量与得舒特组比较差异均不显著(P＞0.05)，提示四神丸对该模型大鼠的作用在中剂量上与西药得舒特效果相当。此外，以上结果还表明，四神丸可能通过调节血清脑肠肽Ghrelin的水平、抑制胃肠蠕动而达到止泻的目的，但其调节Ghrelin的具体分子机制仍需深入研究。

参考文献:

［1］Magdy El-Salhy.Irritable bowel syndrome:Diagnosis and pathogenesis［J］.World J Gastroenterol，2012，18(37):5151-5163.

［2］王文革，次苗苗，张俊红，等.不同剂量生白术对慢传输型便秘大鼠胃肠道传输功能及Cajal间质细胞的影响［J］.长春中医药大学学报，2016，32(1):18-21.

［3］陈志敏，潘新，张美，等.二神丸中药物炮制前后对肠道菌群和UCP2基因表达影响［J］.中国实验方剂学杂志，2016，22(14): 6-9.

［4］蔺晓源，邓娜，李霞，等.四神丸对脾肾阳虚泄泻模型大鼠实验研究［J］.中国中医急症，2016，25(5):756-758.

［5］蔺晓源，张倩倩，刘富林.四神丸治疗肠道疾病的实验研究进展［J］.中医药学报，2016，44(3):115-117.

［6］王燕，何兰娟，朱向东，等.四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠血清TGFβ1、IL-6及结肠组织TLR-4 mRNA表达的影响［J］.中医药学报，2015，43(5):118-122.

［7］张明智，隋海娟，张玲玲，等.橙皮苷对功能性消化不良大鼠胃肠运动及Ghrelin表达的影响［J］.中药药理与临床，2014，30(2): 30-34.

［8］姚辛敏，周妍妍，于淼.脾肾相关的现代研究及临床应用进展［J］.中医药学报，2013，41(1):119-121.

［9］刘弼，陈萍，肖鹏，等.四神丸加味治疗腹泻型肠易激综合征临床观察［J］.辽宁中医杂志，2014，41(3):503-505.

［10］蔡莹，蔺晓源，李玉洁.超微四神丸对泄泻模型大鼠血清细胞因子的影响［J］.中医药学报，2013，41(1):80-81.

［11］蔡莹，蔺晓源，邓娜.超微四神丸对泄泻模型大鼠T细胞亚群的影响［J］.长春中医药大学学报，2014，30(1):12-14.

［12］Tomoaki Matsumura，Makoto Arai.The traditional Japanese medicine Rikkunshito increases the plasma level of ghrelin in humans and mice［J］.Journal of Gastroenterology，2010，45(3):300-307.

［13］陈建林，陈锦锋，邓健敏，等.加味痛泻要方对肝郁脾虚型肠易激综合征患者血清脑肠肽水平的影响［J］.中医药信息，2016，33 (4):82-83.

［14］邓娜，蔺晓源，易健，等.四磨汤有效成分对慢性应激小鼠Ghrelin、Leptin、NO的影响［J］.中医药导报，2014，20(3):12-14.

［15］肖政华，刘柏炎，蔺晓源，等.功能性消化不良患者血浆Ghrelin水平与病情程度的关系及四磨汤的干预作用［J］.陕西中医，2012，33(6):684-686.

Effect of Sishen Pill on the Gastrointestinal Motility and Ghrelin of Rats with Diarrhea of Asdthenic Splenonephro-yang

LI Xia1，LIU Fu-lin1，QING Long-li1，DENG Na1，LIN Xiao-yuan2，3*
(1.Hunan University of TCM，Changsha 410208，China;2.First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Changsha 410007，China; 3.State Key Laboratory Breeding Base for Hunan Provincial Chinese Medicine Powder and Innovative Drugs，Changsha 410208，China)

Objective:To observe the effect of Sishen pill on the gastrointestinal motility and Ghrelin of rats with diarrhea of Asdthenic Splenonephro-yang.Methods:72 SPF SD rats were randomly divided into Normal group，Mode group，Dicetel group，Sishen pill high dose-，medium dose-and low dose groups，with 12 rats in each group.Except the Normal group，other groups were treated with intragastric administration of adenine and Senna Water decoction to replicate model rats with diarrhea of Asdthenic Splenonephro-yang.After 14 days，the general state，diarrhea index，gastric motility and transit function of intestinal movement and serum Ghrelin levels were examined after administering intragastricly.Results:Rats in the Model group，although thegeneral state had improved，the diarrhea still persisted，and the residual rate of gastric，intestinal propulsion rate and serum Ghrelin levels were significantly different compared with those in the Normal group(P＜0.01).In each dose group of Sishen pill and Dicetel group the above indexes were improved compared with those in model group(P＜0.05 or P＜0.01).In Sishen pill high dose group the gastric remnant rate and intestinal propulsive rate were superior to those in other groups(P＜0.05).The serum Ghrelin content in Sishen pill high dose group was superior to that in medium and low dose groups(P＜0.05).But in Sishen pill medium and low dose groups the gastric residual rate and intestinal advance rate and the serum levels of Ghrelin content in the high and medium dose groups had no significant difference compared with those in Dicetel group(P＞0.05).Conclusion:Sishen pill can effectively alleviate the symptom of diarrhea rats with Asdthenic Splenonephroyang，and the effect of high dose group is the best.The mechanism of action may be related to the regulation of gastrointestinal motility and serum Ghrelin level.

Sishen pill;Diarrhea;Asdthenic Splenonephro-yang;Gastric emptying;Intestinal advance;Ghrelin

R28

A

1002-2406(2017)02-0055-04

国家自然科学基金青年项目(No.81403380);湖南省教育厅科研优秀青年项目(No.15B178)

李霞(1991-)，女，硕士研究生，主要研究方向:中医药防治胃肠疾病。

蔺晓源*(1985-)，男，助理研究员，主要研究方向:中医药防治内科重大疾病。

2016-07-19

修回日期:2016-08-10