蛹虫草产量及主要活性物质的影响因素研究*

孙 叶，包建忠，刘 红，马 辉，张 甜，陈秀兰**

（1.江苏里下河地区农业科学研究所，江苏 扬州 225007；2.扬州大学动物科学技术学院，江苏 扬州 225009；3.扬州循天岭生物科技有限公司，江苏 扬州 225007）

DOI：10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.013

蛹虫草产量及主要活性物质的影响因素研究*

孙 叶1，2，包建忠1，刘 红3，马 辉1，张 甜1，陈秀兰1**

（1.江苏里下河地区农业科学研究所，江苏 扬州 225007；2.扬州大学动物科学技术学院，江苏 扬州 225009；3.扬州循天岭生物科技有限公司，江苏 扬州 225007）

以提高蛹虫草子实体产量、活性物质含量为研究目的。以小麦为基本培养基固体培养蛹虫草子实体，采用单因素、二因素试验研究碳源、氮源和菌种对蛹虫草实体产量、活性物质含量的影响。产量单因素实验结果表明，每瓶添加1 g蚕蛹粉、营养液中白砂糖浓度为20 g·L-1的培养基培养子实体产量最高；但不同水平的蚕蛹粉、黄豆粉对子实体产量影响差异不显著。二因素实验结果表明，当培养基营养液中白砂糖浓度为20 g·L-1，蚕蛹粉添加量为2 g·瓶-1时，子实体产量最高；碳源、氮源及碳源和氮源的互作对蛹虫草的产量有极显著的影响。活性物质单因素实验结果表明，培养基营养液中蔗糖浓度为10 g·L-1时腺苷和虫草素含量最高；每瓶培养基中添加1 g土豆粉时，子实体多糖含量最高，与其他营养添加物质有显著差异；不同菌种对产量和主要活性物质含量的影响差异显著。

蛹虫草；产量；活性物质

蛹虫草（Cordyceps militarisLink），又名北冬虫夏草、北虫草，无性型属于蛹草拟青霉 （Paecilomyces militarisLiang），有性世代属于虫草属（Cordyceps），与冬虫夏草（Cordyceps sinensis）同属异种，是虫草属的模式种。现代研究表明，蛹虫草和冬虫夏草有相似的活性成分和药理作用，能增强人体免疫功能、造血能力和抗辐射能力，有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等作用。随着蛹虫草保健功能逐步被消费者认可，相关产品逐步实现产业化，优质高产子实体的培养技术越来越成为研究的热点[1-2]，这些研究能增强蛹虫草产业的竞争力，实现可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 试验材料

菌种：2015年春通过孢子分离方法选育出的母种、原种和栽培种，由扬州循天岭生物科技有限公司提供。

1.1.2 试剂

蛋白胨（北京奥博星）、虫草素（Sigma）、腺苷（Sigma）、硫酸镁、磷酸二氢钾、柠檬酸三氨、葡萄糖、蔗糖、葡萄糖标品、苯酚、浓硫酸、甲醇、无水乙醇等均为国产分析纯；白砂糖、黄豆粉，购置于大润发超市；土豆粉、蚕蛹粉淘宝网购。

1.2 仪器与设备

TGL-16M低温高速离心机，上海沪湘仪；RE-201D旋转蒸发器，郑州特尔仪器设备有限公司；CU600型电热恒温水箱，上海越平科学仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；BS124S电子天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；SOW-25DI冷冻高速微粉机，山东三清不锈钢设备有限公司；Ps-250万能破碎机，南京威利朗食品机械有限公司；RY-NSG-20LC超声波提取浓缩机，海锐元机械设备有限公司；Multiskan Go、Thermo酶标仪、高效液相色谱仪上海汇兴仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 营养物质对蛹虫草产量的影响

保证鸡群都能定期喂料、饮水等，这些工作间隔的时间不能过长，避免鸡感受到饥渴感，最好为鸡提供充足的料槽和水槽等，使用的比例为1∶1，如果为1 000只鸡，准备的水槽和料槽最好各10个。鸡舍内要保证充足通风，保证有害气体的排出；光照也要充足，夏季时，一定要避免强光直接照射鸡舍。此外，还要保证垫料的充足性，保证饲料密度适宜，夏天少、冬天多，最好为每平方米5～10只。如果为不同类型的鸡，要禁止混合养殖。夏季时，要加强防暑和降温工作；冬季时，在鸡舍内喷水，确保鸡舍内的湿度适宜。针对产蛋鸡，也要为其提供充足的产蛋箱，增加捡蛋的次数，发现破壳蛋要及时挑出。

单因素试验研究培养基氮源、碳源等对蛹虫草产量的影响。氮源黄豆粉、土豆粉、蚕蛹粉、蛋白胨添加量分别设置为为1 g·瓶-1、2 g·瓶-1、3 g·瓶-1，各3个水平；碳源蔗糖、葡萄糖、白砂糖添加量分别设置为3 g·L-1、5 g·L-1、7 g·L-1、9 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1，各6个水平，基本培养基为小麦28 g，水或糖营养液50 mL。

二因素试验研究氮源和糖源对产量的影响。氮源黄豆粉、土豆粉、蚕蛹粉的添加量分别设置为1 g·瓶-1、2 g·瓶-1、3 g·瓶-1，各3个水平，蛋白胨添加量分别设置为5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1，3个水平，糖源白砂糖添加量分别设置为2.5 g·L-1、5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1，各5个水平，5个重复。试验菌种为B6栽培种，基本培养基为小麦28 g，营养液或水50 mL。

1.3.2 菌种和营养物质对蛹虫草主要活性物质影响

营养物质对蛹虫草主要活性物质的影响：黄豆粉、土豆粉、蚕蛹粉添加量均分别设置为1 g·瓶-1、2 g·瓶-1、3 g·瓶-1；营养液中葡萄糖、白砂糖、蛋白胨添加量分别设置为5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1，各4个水平，5个重复。试验菌种为B6栽培种，基本培养基为小麦28 g，营养液50 mL。

菌种对蛹虫草主要活性物质的影响：测13个菌种培养的子实体产量和活性物质含量，每个菌种培养10瓶子实体，基本培养基为小麦28 g，含无机盐类营养液50 mL，无机盐类硫酸镁、柠檬酸三铵、磷酸二氢钾，浓度均为0.1%。高效液相色谱测定法测虫草素、腺苷含量[3]，采用苯酚硫酸法（NY/T 1676-2008）测定蛹虫草多糖含量。

1.3.3 数据处理

试验数据采用统计学方法进行处理。单因素、二因素方差分析、正交试验结果极差分析、方差分析、图表制图采用SPSS19.0和Excel软件制作分析。

2 结果与分析

氮源和碳源对蛹虫草子实体产量的影响见表1。

表1 不同氮源添加物对蛹虫草产量的影响Tab.1 Effects of nitrogen source additives in different formula on yield of Cordyceps militaris

由表1可知，每瓶添加1 g蚕蛹粉的培养基，蛹虫草子实体产量最高，与土豆粉比较，蚕蛹粉和黄豆粉都能显著提高蛹虫草的产量，但不同水平处理的蚕蛹粉和黄豆粉对产量的影响差异不显著。不同碳源添加物对蛹虫草产量的影响见表2。

表2 不同碳源添加物对蛹虫草产量的影响Tab.2 Effects of carbon source additives in different formula on yield of Cordyceps militaris

由表2可知，培养基营养液中添加20 g·L-1白砂糖的子实体产量最高，较葡萄糖各处理差异显著，但不同水平处理的蔗糖和白砂糖对子实体产量的影响差异不显著，不同碳源的不同水平处理对产量的影响差异不显著。不同氮源和碳源添加物对蛹虫草产量的影响分析见表3、图1、表4。

由表3、图1边际均值（剔除其他变量影响时算出的均值）可知，随着碳源白砂糖的添加量增加，子实体产量上升；氮源黄豆粉和蚕蛹粉能明显提高子实体产量，且当蚕蛹粉添加量为2 g·瓶-1、白砂糖为20 g·L-1时，子实体产量最高，但不同水平的蚕蛹粉、黄豆粉对子实体产量差异不显著。由表4方差分析表可知，碳源、氮源及碳源和氮源的互作对子实体的产量具有极显著的影响。

2.2 营养添加物和菌种对蛹虫草主要产量和活性物质的影响

不同氮源和碳源对蛹虫草主要活性物质的影响见表5。

由表5可知，培养基营养液中白砂糖浓度为10 g·L-1时腺苷和虫草素含量最高，与其他处理相比差异显著；氮源添加物土豆粉为1 g·瓶-1时，子实体多糖含量最高，与其他处理相比差异显著。菌种对蛹虫草子实体产量和主要活性物质的影响见表6。

由表6可知，菌种B6培养的子实体产量和多糖含量最高，多糖含量与B、B1、B3相比差异不显著，与其他菌种相比差异显著；菌种B1、C6培养子实体的腺苷含量较高，较其他菌种差异显著；菌种C6、H1培养的子实体虫草素含量较其他菌种差异显著。

表3 不同氮源和碳源添加物对蛹虫草产量的影响Tab.3 Effects of nitrogen and carbon source additives in different formula on yield of Cordyceps militaris

3 讨论

蛹虫草子实体的产量和品质受很多因素的影响，目前研究热点主要集中在碳源、氮源、无机盐类、维生素、激素等，以往蛹虫草培养基主要以大米为原料[3-4]，近年来青稞[5]、小麦[6]为原料的培养基越来越得到肯定，与之相关的营养物质和菌种对产量、品质的影响研究也受到重视。本试验发现菌种对蛹虫草子实体产量和活性物质含量的影响有显著差异，目前针对腺苷、虫草素、多糖指标的优良菌种的选育取得了一定进展，选育出综合性状优良的菌种，提高蛹虫草产量和品质，将愈来愈成为生产研究的重点[6-7]。以往的研究[3-5，8-11]证明蚕蛹粉、豆粕、玉米粉、蔗糖、葡萄糖能提高蛹虫草的产量和活性物质含量。本试验发现碳源采用食用白砂糖能提高蛹虫草产量，与试剂蔗糖相比无显著差异，效果比食用葡萄糖好，从生产成本考虑可选择食用白砂糖作为碳源。蚕蛹粉、豆粕[10-11]能提高虫草素和腺苷含量，在以往的研究中已有所报道，但豆粕的品质不容易把握，因此本试验直接采用食用黄豆粉，既保证了食品的安全性，在提高产量和活性物质含量方面取得了很好的效果，这些结果对生产有一定的参考价值。土豆浸出液对食用菌菌丝的生长非常有益，土豆淀粉对虫草子实体的生长影响的研究还未见报道，本试验发现每瓶培养基中添加1 g土豆淀粉时，子实体多糖含量最高，较其他添加物差异显著，但单独添加土豆淀粉，子实体产量显著降低，基于培养基对功能指标的影响，配方研究还有广阔的探索空间。

图1 不同碳源和氮源的产量估算边际均值Fig.1 Production of mean estimate the marginal about different nitrogen and carbon source

表4 不同氮源和碳源添加物对蛹虫草产量影响的方差分析Tab.4 Variance analysis of the effects of different formula of nitrogen and carbon source additives on yield of Cordyceps militaris

表5 不同氮源和碳源对蛹虫草主要活性物质的影响Tab.5 Effects of nitrogen and carbon source additives in different formula on yield of Cordyceps militaris

表6 菌种对蛹虫草子实体产量和主要活性物质的影响Tab.6 Effects of spawn on yield and the main active substancesof Cordyceps militaris fruiting body

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Research on Influencing Factor on Yield and the Main Active Substances of Cordyceps militaris

SUN Ye1,2,BAO Jian-zhong1,LIU Hong3,MA Hui3,ZHANG Tian3,CHEN Xiu-lan1
(1.Institute of Agricultural Sciences of Lixiahe Districts,Yangzhou 225007,China; 2.College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China; 3.Company of Yangzhou Xuntianlin Biological Technology,Jiangsu 225007,China)

The research purposes of this article is to improve the yield and content of active material of Cordyceps militaris fruiting body.With wheat as the basic medium solid culturing C.militaris fruiting body,the influence of carbon source and nitrogen source on yield and main active substance through the single and two factors factor experiment were mainly studied.The single factor experiment on production results showed that the yield of the fruiting body cultured with the culture medium added 1 g silkworm chrysalis powder or nutrient solution with sugar 20 g·L-1was highest,but different levels of subsidiary entity yield difference was not significant on silkworm chrysalis powder,soybean powder.The two factor experiment on production results showed that the yield of the fruiting body cultured with the culture medium added 2 g silkworm chrysalis powder or nutrient solution with sugar 20 g·L-1was highest,and carbon source,nitrogen source and carbon source and nitrogen source against each other had significantly influence on production of C.militaris.The results of single factor experiment on active material showed that the content of adenosine and cordycepin in fruiting body of C.militaris cultured with the culture medium added nutrient solution with sugar 10 g·L-1was highest,and that the content of polysaccharide with the culture medium added 1 g of potatoes was highest,there was a significant difference with other nutritional additive substance.The influence of strains on the yield and the main active substance content was significant difference.

Cordyceps militaris;yield;active substances

S646.9

A

1003-8310（2017）02-0047-05

DOI：10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.013

江苏省农业科技自主创新资金（CX(14)2137）；中央财政农业技术推广项目（TG(15)109）。

孙叶（1978-），女，硕士，副研究员，主要从事作物遗传育种和组织培养研究。E-mail:sunye9999@126.com

**通信作者：陈秀兰（1956-），女，本科，研究员，主要从事辐射诱变育种研究。E-mail:yzchxl@163.com

2017-01-22