瓜蒌薤白半夏汤对ApoE小鼠血脂代谢、氧化应激和主动脉Lox—1表达的影响

郭建恩+米树斌+闫秀川+辛思源+高飞+梁广和+李静华

[摘要] 观察瓜蒌薤白半夏汤（GXBD）在调节血脂代谢、抗氧化、干预ox-LDL/Lox-1通路的作用，探讨其抗动脉粥样硬化（AS）的作用机制。以高脂饲料饲喂雄性Apo-E-/-小鼠42只，建立AS模型。AS模型小鼠随机分为模型组、辛伐他汀组、GXBD高、低剂量组，以C57BL/6J雄性小鼠作为正常对照组；每组10只，连续灌胃给药8周。末次给药后24 h，检测血清TC，TG，LDL-C，HDL-C及SOD，MDA，GSH-px，ox-LDL水平；HE染色觀察主动脉组织结构变化，Western blot和PCR分别检测主动脉Lox-1蛋白表达和mRNA水平。结果显示模型组小鼠血脂指标含量及血清MDA，ox-LDL水平显著高于正常对照组，SOD，GSH-px显著低于正常对照组，主动脉Lox-1蛋白表达水平及其mRNA水平显著高于正常对照组（P<0.05），模型组主动脉出现明显粥样硬化斑块；GXBD高、低剂量组和辛伐他汀组小鼠血脂指标含量及MDA，ox-LDL水平显著低于模型组，SOD，GSH-px显著高于模型组，主动脉Lox-1蛋白表达水平及其mRNA水平显著低于模型组（P<0.05），主动脉组织粥样硬化病变明显减轻。说明调节血脂代谢，抗氧化、抑制Lox-1的表达、干预ox-LDL/Lox-1通路，可能是其抗AS的机制之一。

[关键词] 瓜蒌薤白半夏汤； 动脉粥样硬化； 抗氧化； 血脂； ox-LDL/Lox-1通路

[Abstract] To observe the functions of Gualou Xiebai Banxia decoction（GXBD） on regulating lipid metabolism， anti-oxidation， and interposing ox-LDL/Lox-1 pathway， and to explore its anti-atherosclerosis （AS） mechanisms. AS models were established by using 42 Apo-E-/- male mice with high fat diet. AS model mice were randomly divided into the model group， simvastatin group， and GXBD high and low dose groups. C57BL/6J male mice were used as the normal control group， n=10 and the treatment lasted for 8 weeks. The levels of TC， TG， LDL-C， HDL-C， SOD， MDA， GSH-px， and ox-LDL in blood serum were tested 24 h after the last administration. The changes of aortic tissues structure were observed by HE staining； the expression levels of Lox-1 protein and the expression levels of mRNA were detected by Western blot and PCR respectively.Results showed that the blood lipid levels and MDA， ox-LDL levels in blood serum of model group were significantly higher than those in the normal control group， but SOD， GSH-px levels were significantly lower than those in the normal control group， and the Lox-1 protein and mRNA expression levels were also significantly higher than those in the control group（P<0.05）， namely aortic atherosclerosis lesions were obvious in model group.The levels of blood lipid and MDA， ox-LDL of GXBD high and low dose groups and simvastatin group were significantly lower than those in model group， while SOD， GSH-px levels were significantly higher than those in model group， and Lox-1 protein and mRNA expression levels were significantly lower than those in model group（P<0.05）， namely the aortic atherosclerosis lesions were significantly relieved. The above results indicated that GXBD was capable of modulating blood lipid， anti-oxidation， and inhibiting the expression of Lox-1， and interposing ox-LDL/Lox-1 pathway in the AS model Apo-E-/- mice， which may be one of the mechanisms of anti-atherosclerosis.

[Key words] Gualou Xiebai Banxia decoction； atherosclerosis； antioxidant； blood lipid； ox-LDL/Lox-1 pathway

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病、心肌梗死及脑梗死等多种心脑血管病的主要病理基础，是多种因素共同作用于不同环节的疾病[1]。脂质代谢紊乱、氧化应激、炎癥反应等均不同程度参与了AS的病理过程，氧化低密度脂蛋白（oxidized-low density lipoprotein，ox-LDL）及其受体血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，Lox-1）是影响AS 早期发病的主要因素[2]。瓜蒌薤白半夏汤（GXBD）是张仲景在《金匮要略》中创立的治疗胸痹（冠心病）的著名方剂，现代临床主要用于各种类型冠心病（无症状型、心绞痛型、心肌梗死型、心力衰竭型等）等缺血性心脏病的治疗[3]。药理研究证实，该方能够抗冠脉痉挛、扩张冠状动脉、保护血管内皮、抑制心肌细胞凋亡等，部分揭示了该方保护缺血心肌的机制[4-6]。但是，在该方调节血脂方面作用尚存争议[7]，对抗氧化作用尚有不同意见[8]，保护血管内皮机制尚不完全清楚，且尚未见到该方通过抗AS机制进而抗心肌缺血的报道。本研究拟对GXBD调节血脂、抗氧化及干预 ox-LDL/Lox-1信号通路的作用进行研究，揭示该方通过以上机制抗早期AS的作用，为该方临床应用提供理论基础。

1 材料

1.1 药品 瓜蒌薤白半夏汤：全瓜蒌12 g，薤白9 g，半夏12 g，黄酒（适量）。薤白颗粒（河北祁新中药颗粒饮片有限公司，批号110102）；瓜蒌颗粒（河北安国振宇药业有限公司，批号130301）；半夏颗粒（河北祁新中药颗粒饮片有限公司，批号110903）；辛伐他汀片（涿州东乐制药有限公司，国药准字号H20083227）。

1.2 动物 SPF级Apo-E-/-雄性小鼠42只，6～8周龄，体重18～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号SCXK（京）2012-0001。SPF级雄性C57BL/6J小鼠12只，6～8周龄，体重18～20 g，实验动物许可证号SCXK（京）2012-0001。

1.3 仪器 ESJ200-4型电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）；日立7180全自动生化分析仪（日本日立株式会社）；D-37520高速冷冻离心机（sorvall公司）；Multiskan MK3酶标仪（芬兰Thermo公司）；Rotor-gene 3000 Real-time PCR仪，Cycler PCR仪（Bio-Rad公司）；TE 77 PWR干转仪（Amersham Bioscience公司）；复日FR-980生物电泳图像分析系统、复日Smart view生物电电泳图像分析软件（上海复日科技有限公司）；Western电泳系统（164-5051，Bio-Rad公司）；PCR扩增仪（美国PE公司）；彩色病理图像分析系统（日本Olympus公司）。

1.4 试剂 高脂饲料（配方：1%胆固醇、0.5%胆酸钠、10%猪油、10%蛋黄粉和78.5%基础饲料，批号20150612，北京科澳协力饲料有限公司）；总胆固醇（TC）试剂盒，批号637456- 01，甘油三脂（TG），批号638873-01，以上试剂由日本日立株式会社生产；低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒，批号分别为020307，2400507，以上试剂生产厂家为北京利德曼生化股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（WST-1法），货号A001-3，南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）测试盒，货号A001-3，南京建成生物工程研究所；微量还原型谷胱甘肽（GSH）测试盒（微量酶标法），货号A006-2，南京建成生物工程研究所；小鼠氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒，货号20150716，厦门慧嘉生物科技有限公司；硝酸纤维素膜，Amersham Bioscience公司产品；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），Bio-Rad公司；40% Acrylamide/Bis solution，Bio-Rad公司产品；化学荧光增强试剂盒（lumin enhanced chemiluminecent kit），BCA protein assay kit，ThermoFisher公司产品；蛋白Marker，Famentas公司产品；医用X光胶片（12.7 cm×18.7 cm），购自上海柯达胶片有限公司；Lox-1抗体购自美国Santa Cruz公司。总RNA抽提试剂盒，RNeasy Mini Kit，QIAGEN公司产品；cDNA合成试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit， Fermentas 公司；SYBR Green PCR 试剂，SYBR Premix Ex TaqTM，Takara公司产品；无水乙醇，分析纯，异丙醇，分析纯；引物由TaKaRa公司设计并合成鉴定。

2 方法

2.1 药液制备 取瓜蒌颗粒12 g，薤白颗粒9 g，半夏颗粒12 g，以上药物与200 mL黄酒混匀，煎煮过滤合并药液，减压浓缩至含生药1 g·mL-1。辛伐他汀以蒸馏水配制成1 g·L-1溶液。

2.2 AS模型建立 Apo-E-/-雄性42只、C57BL/6J小鼠12只，适应喂养1周，Apo-E-/-雄性小鼠饲喂高脂饲料（60Co γ灭菌照射处理），C57BL/6J小鼠喂饲普通饲料。8周后，随机解剖Apo-E-/-小鼠及C57BL/6J小鼠各2 只，眼眶取血，3 000 r·min-1离心10 min，检测血脂水平，取小鼠主动脉，HE染色观察主动脉组织结构，确定模型成功建立。

2.3 分组及给药 C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组（NS）；制备成功的40只AS模型小鼠随机分为模型组（MS）、辛伐他汀组（XFTT，5 mg·kg-1）和GXBD-Ⅰ（20 g·kg-1），GXBD-Ⅱ（10 g·kg-1）组，每组10只。给药组按上述剂量灌胃（ig）给药，给药体积20 mL·kg-1；正常对照组及模型组ig等体积的生理盐水，每日1次，连续8周。

2.4 标本获取及處理 末次给药后24 h，以4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，眼眶静脉取血，分离血清，-20 ℃保存用于血清学分析。取血后开胸剥离主动脉全长（从主动脉弓起始到腹主动脉分叉处），生理盐水冲洗后，用于常规形态学检测；其余标本-80 ℃保存，Western blot和RT-PCR法检测组织Lox-1蛋白及其mRNA表达水平。

2.5 小鼠血清血脂指标和氧化应激指标的检测 应用全自动生化分析仪检测各组动物血脂指标TC，TG，LDL-C，HDL-C，氧化应激指标SOD，MDA，GSH-px及ox-LDL水平，按产品说明书要求操作。

2.6 小鼠主动脉粥样斑块病理检测 取主动脉弓部5 mm放入10%甲醛固定，常规乙醇脱水、石蜡包埋、切片，用于常规病理检查。

2.7 小鼠主动脉Lox-1蛋白表达测定 取100 mg主动脉组织，提取总蛋白，制备SDS聚丙烯酰胺凝胶，对处理后的蛋白样品进行SDS-PAGE，转膜70 min，将膜取出，丽春红染色，水洗脱色后，5%脱脂奶粉TBST液封闭，室温震荡1 h，弃封闭液，加入一抗Lox-1（1∶1 000）稀释液孵育，4 ℃过夜，TTBS洗5 min，3次，然后根据一抗的性质加入相应辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液孵育，室温震荡1 h，TTBS洗5 min，3次，除去未结合的二抗，加发光液，曝光。应用复日FR-980生物电泳图像分析系统分析底片中目的条带，并分析条带密度值。作为内参照。每个实验重复3批以上不同样本。

2.8 Real-time PCR测定主动脉Lox-1 mRNA表达 按照QIAGEN公司RNeazy Mini Kit说明提取主动脉组织总RNA，酶标仪检测260 nm和280 nm波长吸光度，以计算A260/A280估计RNA纯度（正常值1.8～2.0），质量浓度=A260×40×100（稀释倍数）（g·mL-1）。在冰浴的无核酸酶的离心管中加入反应混合物进行逆转录反应。于PCR反应管中加入反应混合物进行Real-time PCR：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物（5 μmol·L-1）各1 μL（Lox-1上游引物5′-ACGGTTCTCCTTTGATGC-3′，下游引物5′-CTCTTAGGTTTGCCTTCTTC-3′；GAPDH上游引物5′-GGCATTGTGGAAGGGCTC-3′，下游引物5′-GACCTTGCCCACAGCCTT-3′），模板cDNA 1 μL、去离子水7 μL；反应条件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 20 s，40个循环进行扩增。

2.9 数据处理 使用SPSS 17.0数据处理软件包进行统计学分析，计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 t 检验，以 P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 瓜蒌薤白半夏汤对小鼠血清血脂水平的影响 模型组小鼠血清TG，TC，LDL-C水平高于对照组，HDL-C水平低于对照组（P<0.05）。各给药组小鼠血清TG，TC，LDL-C水平低于模型组，HDL-C水平高于模型组（P<0.05），见表1。

3.2 瓜蒌薤白半夏汤对Apo-E-/-小鼠SOD，GSH-px，MDA，ox-LDL的影响 模型组小鼠血清SOD，GSH-px水平低于对照组，MDA，ox-LDL含量高于对照组（P<0.05）。各给药组小鼠血清SOD，GSH-px水平高于模型组，MDA，ox-LDL含量低于模型组（P<0.05），见表2。

3.3 瓜蒌薤白半夏汤对小鼠主动脉Lox-1蛋白及mRNA表达的影响 模型组主动脉组织中Lox-1蛋白表达水平高于对照组（P<0.05）。各给药组主动脉组织中Lox-1蛋白表达低于模型组（P<0.05）。各给药组主动脉组织中Lox-1 mRNA表达低于模型对照组（P<0.05），见图1，表3。

3.4 瓜蒌薤白半夏汤对小鼠主动脉组织形态学的影响 对照组：动脉内膜完整且平滑，动脉内膜表面的内皮细胞呈褶皱状均匀排列；模型组：血管内壁有残损，管腔出现粥样硬化斑块，斑块表面可见由大量胶原纤维以及少量的平滑肌纤维帽，斑块内脂质含量丰富，纤维帽下方散在大量泡沫细胞和一些炎细胞[9]；GXBD低剂量组：血管内壁偶有残损，血管腔可见粥样硬化斑块，斑块面积较模型组小，脂质含量也较模型组少，斑块内可见少量泡沫细胞及炎性细胞；GXBD高剂量组及他汀组：血管内壁较为光滑，偶见内膜残损，偶见泡沫细胞聚集和炎细胞浸润，见图2。

4 讨论

中医无AS一说，据其临床表现，多与中医之“胸痹”、“真心痛”、“中风”、“眩晕”、“头痛”等病证相联系，痰浊是AS发病的主要病理因素之一[9]。《金匮要略》认为，胸痹之病机为“阳微阴弦”，胸阳不足、痰浊水湿痹阻，表现为喘息咳唾，胸背痛，短气等，治以宣痹通阳。瓜蒌薤白半夏汤为治疗“胸痹不得卧，心痛彻背”为主要表现的方剂，由全瓜蒌、薤白、半夏、白酒（低度米酿酒）组成，具有行气解郁，通阳散结，祛痰宽胸之效。现代药理研究显示，该方可通过降低CK，LDH，调解Bcl-2，Box 蛋白表达，抑制炎症信号通路NF-κB、诱导提高JAK-STAT信号通路表达，干预（IL）-1β，IL-6，IL-10基因表达等多方面保护缺血心肌[10-12]。但是，现代临床多将本方用于无症状型、心绞痛型等冠心病的治疗[3]，而冠心病的病理基础为AS，故从本方抗AS机制入手进行研究，更能揭示该方抗心肌缺血的机制，更接近于临床应用之实际。

脂质代谢异常、氧化应激（OS）是早期AS重要的危险因素[13]。在长期HLP的情况下，增高的脂蛋白和胆固醇可对动脉内膜造成功能性和结构性损伤，卢志顺等[14]研究证实，血浆中游离胆固醇达到一定浓度时，可引起内皮细胞膜结构的改变。同时，正常机体内活性氧的生成和清除处于一种动态平衡，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等是维持体内氧化与抗氧化平衡的重要活性物质。在氧化平衡被打破的情况下，脂质发生过氧化，产生毒性代谢终产物如丙二醛（MDA），能破坏细胞结构及功能，导致局部血管病理损伤和血管机能异常。另外，通过损伤的内皮细胞渗透进入动脉内膜下的LDL，在氧自由基（ROS）氧化修饰下变为ox-LDL。目前认为，ox-LDL具有细胞毒性作用，能够诱发动脉内皮功能和结构的损伤，在动脉粥样硬化发生、发展中起到重要作用[15]。以上多个环节共同造成了动脉内皮功能和结构的持续性损伤。

Lox-1是一种在内皮细胞丰富表达的Ⅱ型单链跨膜蛋白，可以结合、吞噬并降解ox-LDL，是介导血管内皮细胞摄取ox-LDL的主要受体之一。研究发现[16]，Lox-1结合ox-LDL后可迅速诱发内皮细胞ROS升高，特别是超氧阴离子和H2O2显著升高，升高的ROS除作为第二信使外，还直接作用于内皮细胞，使NO失活和NF-κB活化，胞膜脂质过氧化[12，17]。而ox-LDL通过Lox-1与血管内皮细胞相互作用，引起如前所述的内皮细胞损伤及内皮功能障碍，是触发AS病理过程的重要因素。同时，Lox-1尚可激活许多信号转导途径，参与AS病理的进展过程。因此，调节血脂代谢、抗氧化、调节Lox-1表达水平都是AS治疗中的重要环节。

本研究以Apo-E小鼠复制AS病理模型，观察GXBD对AS小鼠血脂代谢、氧化应激、血管内皮功能等的影响。研究结果显示，GXBD各组和辛伐他汀组小鼠血清TG，TC，LDL-C水平显著低于模型组（P<0.05），HDL-C水平显著高于模型组（P<0.05），说明GXBD可降低AS小鼠血脂水平。HE染色显示GXBD各组和辛伐他汀组主动脉组织粥样硬化病变较模型组减轻，说明GXBD可抑制AS小鼠动脉粥样硬化形成，并且与辛伐他汀片疗效相当。GXBD各组和辛伐他汀组小鼠血清SOD，GSH-px水平高于模型组（P<0.05），MDA，ox-LDL水平低于模型组，说明GXBD通过干预氧化应激分子水平，降低AS小鼠氧化应激反应。GXBD各组和辛伐他汀组小鼠主动脉Lox-1蛋白及其mRNA表达低于模型对照组（P<0.05），说明GXBD可以通过干预Lox-1表达，降低氧化应激对AS小鼠的影响，从而改善AS小鼠血管内皮功能。综上所述，瓜蒌薤白半夏汤能够调节AS小鼠血脂代谢、抗氧化、干预ox-LDL/Lox-1通路，可能是其抗AS的部分机制。

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