药效学结合正交试验优选参连颗粒剂的醇提工艺
2017-03-28王敏杜守颖陈笑南田志浩陆洋白洁
王敏+杜守颖+陈笑南+田志浩+陆洋+白洁+武慧超+张勤帅+万洁
[摘要] 对参连方中醇提部分工艺进行优选。在以致豚鼠心律失常时哇巴因的消耗量为药效指标,考察全方水提,全方水提醇沉,党参等水提醇沉,丹参等醇提和党参等水提、丹参等醇提4种不同提取工艺路线的基础上,采用L9(34)正交表进行正交实验,以不同实验方案的出膏率及丹酚酸B、丹参酮ⅡA、小檗碱3种指标成分的含量为评价指标,研究乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数4个因素对醇提部分提取工艺的影响,应用综合评分法优选最佳提取工艺,并进行工艺验证试验。所得最佳提取工艺为加入60%乙醇共提取2次,分别加入10,9倍量、提取2.0 h,丹酚酸B、丹参酮ⅡA、小檗碱提取量分别为42.01,0.41,40.15 mg·g-1。优选的工艺稳定、可行,可为参连颗粒的工业化生产提供依据。
[关键词] 参连方; 醇提; 正交试验; 多指标加权综合评分法
[Abstract] To optimize the ethanol extraction process for Shenlian formula. On the basis of the pharmacodynamics index for different extraction process routes, the contents of salvianolic acid B, tanshinone ⅡA and berberine, as well as the extraction ratio in different experimental schemes were used as the ethanol extraction examining indexes, and multi-criterion synthesizing grading method was used for data analysis to optimize and verify the ethanol-extraction process conditions in orthogonal experiment. The optimum ethanol extraction process was as follows: adding 60% ethanol, 10 times amount, extracting for 2.0 h each time for a total of 2 times. This extraction process showed good stability and availability.
[Key words] Shenlian formulaion; ethanol-extraction; orthogonal test; multi-index comprehensive weighted score evaluation
参连方为北京中医药大学东方医院经验方,由丹参、黄连、川芎等11味药组成,具有益气活血、清热化痰、安神复脉的功效,用于治疗冠心病室性期前收缩属气虚血瘀、痰热扰心证,症见心悸心烦、怕热喜凉、气短、舌暗苔腻。该方临床效果显著:2010—2013年使用该方治疗的总有效率为82.2%,前期研究表明,其具有明显抗乌头碱、氯化钙和异丙肾所致大鼠心律失常作用[1-2]。
因该方临床治疗效果显著,本课题组拟按照《药品注册管理办法》的要求,对参连处方进行新药开发。药效学试验对处方工艺路线进行了初选,对方中醇提部分丹参、黄连、川芎、远志等药味的提取工艺进行研究,选择丹酚酸B、丹参酮ⅡA、小檗碱为考察指标,进行正交试验,采用多指标加权评分法优选最佳提取工艺。为参连颗粒的研发提供实验支持。
1 材料
LC-20AD岛津高效液相色谱仪(SPD-M20A,PDA检测器,LC Solution色谱工作站);Purospher RP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);赛多利斯BT 25S电子分析天平(北京赛多利斯公司,1/10万);KQ5200型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司);DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司);SHB-Ⅲ型水循环多用真空泵(上海振捷实验设备有限公司);FE20型实验室pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);ZNHW型智能控温电热套(北京中仪泓瑞科技发展有限公司);DZF-6051真空干燥箱(利康达圣科技发展有限公司)。
丹酚酸B对照品(批号111562-201313,纯度97.0%),丹参酮ⅡA(批号110766-200619,纯度98.0%),盐酸小檗碱对照品(批号110713-201212;86.7%)均购自中国食品药品检定研究院。
处方中丹参、黄连、川芎等饮片均购自北京本草方源药业有限公司,经北京中医药大学刘春生教授鉴定均符合2015年版《中国药典》饮片标准,含量测定结果均合格。
乙腈(Fisher公司,色谱级);磷酸(TED公司,色谱纯);娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司);哇巴因(Sigma-Aldrich公司)磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠等固体试剂为分析级;其他试剂为色谱级;95%药用乙醇(北京高华伟业食品添加剂有限公司)。
普通級豚鼠60只,体重240~320 g,北京芳元缘养殖场,许可证号SCXK(京)2009-0014。
2 方法
2.1 丹酚酸B、丹参酮ⅡA、小檗碱含量测定的色谱条件[3]
丹酚酸B:乙腈-0.1%磷酸(22∶78),检测波长286 nm,柱温30 ℃,进样体积为10 μL,流速1.2 mL·min-1,色谱图见图1。
丹参酮ⅡA:流动相A为乙腈,B为0.02%磷酸,梯度洗脱(0~6 min,39%B;6~20 min,39%~10%B;20~20.5 min,10%~39%B;20.5~25 min,39%B),流速1.0 mL·min-1,检测波长270 nm,柱温25 ℃,进样体积20 μL。隐丹参酮、丹参酮Ⅰ含量测定方法同丹参酮ⅡA:以丹参酮ⅡA对照品为参照,以其相应峰为S,计算隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的相对保留时间,相对保留时间应在该规定值的±5%。以丹参酮ⅡA的峰面积为对照,分别乘以校正因子,计算隐丹参酮、丹参酮Ⅰ含量。隐丹参酮:相对保留时间为0.75S,校正因子1.18;丹参酮Ⅰ:相对保留时间为0.79S,校正因子1.31,色谱图见图2。
小檗碱:流动相乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾(50∶50,每100 mL中加入十二烷基硫酸钠0.4 g,磷酸调pH 3.85),检测波长345 nm,柱温30 ℃,进样体积10 μL,流速1.0 mL·min-1。表小檗碱、黄连碱、巴马汀含量测定方法同小檗碱:以小檗碱的峰面积为对照,计算表小檗碱、黄连碱、巴马汀的含量,用待测成分相对保留时间确定峰的位置。与小檗碱的保留时间T对照,则表小檗碱、黄连碱、巴马汀的相对保留时间分别为0.71T,0.78T,0.91T。相对保留时间在规定值的±5%,色谱图见图3。
2.2 哇巴因致豚鼠心律失常试验及指标成分含量测定
2.2.1 分组与给药 动物随机分为5组,每组8只,分别为对照组(生理盐水组),参连提取物Ⅰ(水提组),参连提取物Ⅱ(水提醇沉组),参连提取物Ⅲ(党参等水提醇沉,丹参等醇提组),参连提取物Ⅳ(党参等水提,丹参等醇提组)。豚鼠麻醉后,经十二指肠给药。给药60 min后,分离左侧颈外静脉,以微量注射泵恒速给入哇巴因(100 g·mL-1,0.1 mL·min-1),观察动物出现室性早搏、室性心动过速(室动过速)、心室颤动及心脏停搏的时间,并计算哇巴因消耗量。
2.2.2 提取物含量测定 取浸膏约0.1 g,精密称定,置10 mL量瓶中,加入甲醇5 mL,超声20 min,甲醇定容至刻度线,混匀,按照2.1项下色谱条件,测定丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的含量。
2.3 正交试验
2.3.1 正交试验设计 对处方中丹参、黄连、川芎等饮片进行乙醇回流提取,设置乙醇浓度、乙醇倍量、提取时间、提取次数3个因素,采用L9(34)正交表设计优选最佳提取工艺。因素水平表见表1。
2.3.2 吸醇倍量考察 称取处方量的丹参、黄连、川芎等饮片,加入6倍量不同浓度乙醇,密封浸泡12 h,滤过,量取滤液体积,平行操作3份,考察饮片的吸醇倍量。
2.3.3 正交试验 称取处方量的醇提组饮片,按照正交方案表进行试验。加热回流提取,滤过,合并滤液,浓缩,将浓缩液定容至1 000 mL,混匀,取样离心,过0.45 μm微孔滤膜进行含量测定。加权公式为M=(0.5O/Omax+0.2P/Pmax +0.3Q/Qmax)×100(O为小檗碱,P为丹参酮ⅡA,Q为丹酚酸B,Omax,Pmax,Qmax分别为各成分的最高含量)对指标性成分的含量进行分析。统计分析软件为SAS 8.2。
另取处方量药液,浓缩至清膏,转移至已知质量的蒸发皿,水浴浓缩至稠膏,至真空干燥箱中,60 ℃,0.09 MPa条件下减压干燥,称重,计算出膏率。
2.3.4 验证试验 将软件分析出的最佳工艺组合和正交表综合评分最高的组分别进行提取。提取方法同2.3.3项下方法,含量测定方法同2.1。对于提取次数为3次的,采取合并前2次提取液定容至1 000 mL,第3次单独定容至400 mL,分别进行含量测定。3次提取含量为前2次测得的含量与第3次的含量之和。每组平行3份。
3 结果
3.1 药效试验
提取物Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ含生药量分别为3.26,4.36,3.67,3.04 g·g-1,为使豚鼠所给生药剂量相等,提取物Ⅰ组给予1.86 g·kg-1,Ⅱ组1.38 g·kg-1,Ⅲ组1.66 g·kg-1,Ⅳ组2.00 g·kg-1,折合生药量均为6.0 g·kg-1。哇巴因为致心律失常的药物,与对照组(模型组)比较,参连不同工艺组发生室性早搏、室动过速、心室颤动及心脏停搏等各种不同程度心律失常时哇巴因消耗量均明显增加(P<0.05或P<0.01),但是各组之间无明显的统计学意义,说明参连方对哇巴因致豚鼠心律失常具有显著效果,见表2。
3.2 各组提取物含量
因醇提部分饮片有效成分含量测定为工艺Ⅲ和Ⅳ较高,即单独醇提取较优,见表3。水提部分Ⅳ(水提)较Ⅲ(水提醇沉)有效成分含量较高,转移率也较高。药效学虽无统计学差异,但Ⅳ具有明显变好的趋势,优选工艺Ⅳ,即党参等部分饮片水提取,丹参等部分醇提取,并对醇提取部分进行优化。
3.3 正交出膏率测定
正交试验方案出膏率的测定结果见表4,出膏率最大为3号,最小为1号。
3.4 吸收溶剂倍量考察
饮片可吸取自身质量1倍的溶剂量,见表5。
3.5 正交试验
按照正交表方案进行试验,测定各成分的含量,含量结果以每克饮片提取出成分的质量表示,以综合值进行统计分析,结果见表6,方差分析见表7。方差分析结果表明,A(乙醇浓度)、B(乙醇倍量)、C(提取时间)与D(提取次数)均有较显著性影响,故选择A2B2C3D3,与正交表含量最高3号A1B3C3D3进行验证。
3.6 验证工艺
按照A2B2C3D3、A1B3C3D3因素水平表进行验证,提取方法同2.3.3。含量测定同2.1项下方法。含量测定结果见表8,软件分析结果见表9。3份样品含量测定结果无明显差异,独立样本t检验结果表明,A2B2C3D3与A1B3C3D3无统计学差异。根据生产成本,选择使用乙醇浓度较低的,选择A1B3C3D3,比较煎煮2次和煎煮3次,即A1B3C3D3和A1B3C3D2,無显著型差异,故选择煎煮2次,即A1B3C3D2。即最终选择60%乙醇,第1次加入10倍量,煎煮2.0 h,第2次加入9倍量,煎煮2.0 h,共煎煮2次。
4 讨论
参连方由11味中药组成,处方较大,主要以党参、丹参、黄连、赤芍、白芍为主,治疗冠心病室性期前收缩导致的心律失常,临床应用形式为汤剂。故设计工艺Ⅰ(全方水提);为减少出膏率,富集有效成分,设计工艺Ⅱ(全方水提醇沉);因党参、白芍、赤芍、甘草等主要药效成分在水中溶解度较大,丹参等药效成分在水中溶解度较大[4-7],故设计工艺Ⅳ(党参等水提,丹参等醇提)为减少水提出膏率,设计工艺Ⅲ(党参等水提醇沉,丹参等醇提)。通过药效学初选提取工艺路线。2015年版《中国药典》丹参含量测定内容为丹酚酸B(单独测定),丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ(一测多评),黄连测定内容为小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀(一测多评),故在工艺路线筛选时对这几种成分均进行了含量测定。正交试验中,为减少加权评分时的复杂,本实验选择了与药效相关性较强,且含量较高的君药和臣药中的成分丹酚酸B、丹参酮ⅡA、小檗碱为工艺优选的指标成分[8-9]。
丹酚酸B稳定性较差[10],为避免长时间干燥对指标成分含量测定的影响,实验中采取提取液浓缩至一定程度后,定容到一定体积,直接进行含量测定。正交综合评分中,因各成分的含量不在一个数量级别,采取归一化法进行加权评分,丹酚酸B和丹参酮ⅡA均为丹参饮片成分,故二者共赋0.5,又丹酚酸B较丹参酮ⅡA治疗冠心病疗效更显著,所以丹酚酸B权重系数为0.3,丹参酮ⅡA为0.2。虽然正交试验筛选结果均为提取3次,结合实际生产提取便捷性,在不影响药效成分含量的前提下,应尽可能减少提取次数,故对提取3次和2次进行了比较。结果表明提取2次和3次指标成分含量无统计学差异,最终选择提取2次[11]。通过实验研究,本文确定了参连颗粒剂的醇提组最佳工艺,为后续的制剂工艺研究奠定了基础。
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