响应面法优化超声提取甘草渣中甘草总黄酮工艺研究*

谢 斌，李学坤，郭慧辉

（1.陕西省西安植物园，陕西省植物研究所，陕西西安710061；2.西安文理学院，陕西西安710065）

响应面法优化超声提取甘草渣中甘草总黄酮工艺研究*

谢 斌1*，李学坤2，郭慧辉2

（1.陕西省西安植物园，陕西省植物研究所，陕西西安710061；2.西安文理学院，陕西西安710065）

以甘草渣为实验材料，研究并优化利用超声辅助提取甘草渣中甘草总黄酮的提取工艺。以得率为指标，采用响应面法优选最佳提取工艺。结果表明：最优提取条件为药材粉末加37倍量体积分数为67%的乙醇溶液，超声提取1.2h，甘草总黄酮得率为0.933%。优选所得的工艺稳定可行，可作为甘草总黄酮的提取工艺。

甘草渣；甘草总黄酮；提取工艺；响应面法

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）是中国传统中药的一种，因其味甘、性平，调和诸药并且可以解毒，享有“中药之王”的美誉[1]。甘草酸是从甘草水提物中分离出来的，用作甜味剂。甘草渣是大多数甘草加工企业提取甘草中的甘草酸后产生的废弃物，甘草渣中还含有大量脂溶性的甘草黄酮。甘草黄酮是甘草中的主要成分之一，其具有良好的药理活性，用于化妆品业，具有抗衰老作用和抗艾滋病病毒作用[2]。目前，对于甘草黄酮提取分离的研究大多是对新鲜采集的甘草原材料，往往忽视了甘草在提取甘草酸后产生的废渣，导致了较严重的资源浪费和环境污染。对于日益高涨的市场需求而言，从甘草渣中提取分离甘草黄酮是对直接从甘草原料中获得甘草黄酮的补充和加强。

响应面法在小区域内用简单的多元二次回归方程建立关于因素与影响值的函数关系[3]，通过响应面分析法可以找到最佳点，并灵敏考察各因素之间的交互作用[4]，具有试验周期短、回归方程精度高等优点[5]。本文对甘草渣中甘草总黄酮的提取条件进行了响应面优化，对乙醇的体积分数、提取时间以及液固比这些提取条件做了系统的研究，对上述提取条件实现了优化。

1 实验部分

1.1 仪器及药品

双光紫外可见分光光度计（UV2550，岛津）；超声波清洗仪（SQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（RV10，IKA）。

无水乙醇（市售分析纯）、芦丁对照品（ARO，Sigma）；

甘草药材采自新疆阿克苏地区。洗净，50℃干燥后用万能粉碎机粉碎，过80目筛，除去其中甘草酸，过滤、烘干、放置于干燥器中备用。

1.2 方法

1.2.1 甘草总黄酮的紫外分光光度法测定本实验甘草总黄酮含量采用NaNO2-Al（NO3）3比色法在选定波长360nm处进行测定[6]。对不同浓度的芦丁标准品测定其吸光度，得到吸光度Y与芦丁含量X（mg·mL-1）间的回归方程Y=14.435X+0.0525，R2=0.981，在0.004～0.02mg·mL-1范围内有良好的线性关系[7]。

图1 芦丁和甘草黄酮的最大吸收波长Fig.1 Maximum absorption wavelength of rutin and flavonoids

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Standard curve of rutin

取配制好的样品溶液，在选定波长360 nm处测定吸光度（参比溶液为空白），代入回归方程中求甘草渣中黄酮类物质的含量（质量浓度），计算甘草渣中黄酮类物质的得率[8]：

W=（C×F×V）/m×100%

式中W：总黄酮含量%；C：溶液浓度mg·mL-1；F:溶液稀释倍数；V:溶液体积mL；m：样品质量mg。1.2.2甘草总黄酮的提取本实验采用超声波辅助提取的方法，在甘草渣粉末中加入乙醇，在250W的超声清洗仪中提取，过滤即得甘草总黄酮滤液。

2 结果与讨论

2.1 甘草总黄酮含量测定方法学考察

2.1.1 精密度、重现性和稳定性取同一芦丁对照品溶液，测定吸光度，重复6次，其RSD为1.16%；取供试样品溶液1份，重复测定6次，12、24、36、48h同法测定，发现甘草总黄酮含量日内和日间标准偏差分别为1.24%和1.53%。表明供试样品溶液在48h内稳定性较好，重现性好，精密度较高。

2.1.2 加样回收率精密吸取已测定甘草总黄酮的供试液3份，加入3个不同浓度的芦丁对照品溶液，按给定的分光光度法测定的吸光度，计算甘草总黄酮回收率。结果表明，平均回收率为98.68%，说明本方法准确可靠。

2.2 不同工艺结果对比

通过对比实验可知超声提取法所得甘草总黄酮的平均得率（0.819%），优于热回流（0.725%）及索氏提取（0.736%）的方法，因此，后续采用超声提取法进行研究。

2.3 单因素实验结果

通过对提取过程中乙醇体积分数、时间、液固比这些因素对实验的影响考察，可知乙醇体积分数在60%～70%、提取时间0.5～1.5h、液固比在20∶1～40∶1的范围内提取效果较好。

2.4 因素水平的选择

乙醇的体积分数（A）、提取时间（B）和液固比（C）是决定得率的重要因素。在单因素筛选的基础上，拟按3因素3水平试验，根据响应面RSM中Box-Behnken的中心组合实验设计原理[9]设计优化实验，见表1。

表1 实验因素水平表Tab.1 Experimental factors and levels

应用响应面软件对实验进行设计，并对所得实验结果回归分析，实验设计及结果分析见表2、3。

表2 响应面中心组合试验结果Tab.2 Box-Behnken response values

6 6 5 1 . 0 3 0 0 . 9 2 6 7 7 0 1 . 0 4 0 0 . 9 1 3 8 6 0 1 . 0 4 0 0 . 8 1 4 9 6 5 1 . 5 4 0 0 . 8 6 6 1 0 7 0 0 . 5 3 0 0 . 8 6 2 1 1 6 5 0 . 5 2 0 0 . 7 2 3 1 2 6 5 1 . 0 3 0 0 . 9 1 4 1 3 7 0 1 . 5 3 0 0 . 8 9 5 1 4 6 5 0 . 5 4 0 0 . 8 4 8 1 5 6 0 0 . 5 3 0 0 . 6 9 2 1 6 6 0 1 . 0 2 0 0 . 6 9 3 1 7 6 0 1 . 5 3 0 0 . 7 3 2

表3 提取实验结果方差分析表Tab.3 Result of analysis of variance

由表3可知，提取过程数学模型的F值=111.58＞F0.01（9,7）=6.71，显著性水平P值＜0.0001，说明该模型是极显著的，即用该模型来分析各因素对黄酮得率的影响是合理的。失拟项显著水平P值0.1775，大于0.05，说明失拟项不显著。方程的一次项、二次项都是显著的，说明各试验因子对响应值的影响并非简单线性关系。由F值比较得出，总黄酮得率因素影响的大小依次为：乙醇体积分数、提取液固比、提取时间。

对二次回归方程的响应面分析结果见图3。

图3 提取各因素对甘草总黄酮得率响应曲面图Fig.3 Response surface Chart of the effect of extraction ingredients to the yield of Licorice flavonoids（A:The volume fraction of ethanol;B:time;C:solid-liquid ratio.）

由图3 a和b可以看出，随着乙醇体积分数的增加，得率增加明显，曲面陡峭，即微小增量都能明显提高得率，说明乙醇体积分数的影响最为显著；由图3 b和c图可以看出，随着固液比的增加，得率的增加也较为明显，曲面陡峭，说明液固比的影响也较为显著；图3 a和c图上反映出的提取时间对得率的影响较乙醇体积分数和液固比来说显著性不强，曲面较为平缓，与表3中数据吻合，因此，总黄酮得率因素影响的大小依次为：乙醇体积分数、提取液固比、提取时间，与表3中结果一致。从响应曲面投影等高线图3上可以初步分析：在一定范围内，总黄酮得率随乙醇体积分数的升高、提取时间的增加和液固比温度增加而增加。经软件对各因素回归拟合后，得到回归方程：

R=0.92+0.077A+0.020B+0.044C-0.002AB-0.021AC-0.013BC-0.055A2-0.072B2-0.043C2

根据所得到的模型，预测在稳定状态下的最大总黄酮得率为0.940%，优化条件为：乙醇体积分数为67%、提取时间1.2 h，液固比37.06：1 L·g-1。采用上述优化条件进行甘草总黄酮的提取，考虑到实际操作的便利，将提取液固比调整为37：1 L·g-1，共进行了3次平行试验，得率分别为0.942%、0.929%和0.928%，平均值为0.933%，与预测值接近，且均高于探索试验，重复性好。

3 结论

本实验为甘草渣中甘草总黄酮的提取提供了较优化的工艺条件，即甘草渣粉末在液固比为37∶1（L· g-1）的67%的乙醇溶剂内，超声提取1.2h。实验结果与文献报道的0.70%得率相比较，甘草总黄酮的得率有明显的提高，达到0.933%。回归分析和验证实验表明了该响应面法的合理性和可行性。

［1］马彩梅.甘草及甘草渣的综合利用研究进展［J］.现代农业科技,2015,13（1）：119-121.

［2］朱菊华.甘草黄酮类化合物提取分离的研究进展［J］.中国药业,2010,19（7）：88-90.

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［4］陈睿,杨范莉,张琳.响应面分析法优选桑寄生总黄酮的提取工艺［J］.西北药学杂志,2016,31（4）：367.

［5］冯庆华,徐向阳,夏高飞.响应面法优化玫瑰总黄酮超声提取工艺［J］应用化工,2014,43（12）：2239-2242.

［6］郭艳茹,林洁.乙醇浸提甘草总黄酮的工艺研究［J］.北方园艺, 2013,（24）：158-161.

［7］谢斌,周军辉.甘草渣中甘草总黄酮提取工艺优化研究［J］.应用化工,2015,45（6）：1120-1123.

［8］马洁桃,张岭,王茵.黄酮类化合物的降脂活性及作用机制的研究进展［J］.信中国预防医学杂志,2011,12（4）：370-372.

［9］Rohit Upadhyay,Ganesh Nachiappan,Hari Niwas Mishra.Ultrasound-Assisted Extraction of Flavonoids and Phenolic Compounds from Ocimum tenuiflorum Leaves［J］.Food Science and Biotech nology,2015,24（6）：1951-1958.

Optimization extracting the licorice flavonoids from residue of glycyrrhiza using response surface analysis*

XIE Bin1*,LI Xue-kun2,GUO Hui-hui2
（1.Xi′an Botanical Garden of Shaanxi Province，Institute of Botany of Shaanxi Province，Xi′an 710061,China;2.Xi′an University,Xi′an 710065,China）

The residue of Glycyrrhiza was taken as test materials.Ultrasonic-assisted extracting licorice flavonoids from the residue of Glycyrrhiza was studied and optimized.Taking the yield of flavonoids as index,the response surface analysis was applied for optimizing the extracting technology.The results showed licorice flavonoids were extracted by which 37 times 67%ethanol was added to the residue powder,then it was extracted by ultrasonic for 1.2h.The yield of licorice flavonoids was 0.933%.The optimized technique was available and stable, which can be applied as the extracting technology of licorice flavonoids.

the residue of Glycyrrhiza;licorice flavonoids;extracting technology;response surface analysis

R284.2；TQ041+.8

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170313

2017-01-17

陕西省科学院科技计划项目（No.2014K-28）

谢斌（1985-），男，台湾台南人，硕士，主要从事植物化学方面的研究。