尿源性干细胞移植在糖尿病肾病治疗中的研究进展*

黄英姿 综述，张克勤 审校

(第三军医大学西南医院肾科，重庆 400038)

·综 述· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.04.043

尿源性干细胞移植在糖尿病肾病治疗中的研究进展*

黄英姿 综述，张克勤△审校

(第三军医大学西南医院肾科，重庆 400038)

尿源性干细胞；细胞治疗；干细胞移植；糖尿病肾病

近年来随着细胞治疗技术的快速发展，对于干细胞在慢性肾脏病中的研究与应用已成为肾脏病领域的研究热点。干细胞是人体的起源细胞，存在于胚胎及成体中，是一种具有自我更新能力及在特定条件下可以分化为多种终末细胞的特殊细胞。依据来源不同，干细胞可分为胚胎干细胞、成体干细胞、诱导性多能干细胞。目前，干细胞移植已经广泛应用于慢性肾脏疾病的治疗。胚胎干细胞因其来源困难，存在伦理问题，且本身具备致瘤性而临床鲜有应用。诱导性多能干细胞是将成熟体细胞经“插入式”基因操作诱导方法或“无插入式”诱导方法，获得诱导性多能干细胞，其具有与胚胎干细胞相同的多能性，但同样存在致瘤性，且移植后形成的局部诱导微环境也有可能引起移植部位宿主细胞的“癌性转化”，遗传安全性无法稳定控制。

成体干细胞来源于成熟个体各种组织和器官，主要包括造血干细胞、骨髓间充质干细胞、尿源性干细胞(urine-derived stem cells，USCs)、神经干细胞等。与胚胎干细胞和诱导性多能干细胞相比，成体干细胞来源广，获取相对容易，致瘤风险低，所受伦理争议少，且同样具有多向分化潜能，因此广泛应用于临床。其中，USCs作为一种新型的干细胞来源，具有良好的多向分化潜能，制备过程简便、无创、成本低，且具备高度的自我更新能力，成为了细胞替代治疗中更为理想的种子细胞来源。本文就USCs的生物学特性及其在糖尿病肾病治疗中的研究进展作一综述。

1 USCs的生物学特性

2008年，Wake Forest大学再生医学实验室的Zhang等[1]首次报道从清洁尿液中分离得到一种贴壁生长的细胞，这类细胞具有高度的增殖能力，且能分化表达泌尿道上皮、平滑肌组织、内皮细胞、间质细胞标志物，因此称之为USCs。

1.1 USCs的形态 目前所已知的USCs形态主要有两种，一种是Zhang等[1]所培养的克隆边缘较规则、细胞排列紧密、细胞体积较小和形如米粒的UCSs，一种是Guan等[2]培养的克隆边缘不规则、细胞排列松散、细胞体形呈“纺锤形”的USCs。而引起USCs不同形态的差异现尚不清楚，但比较Zhang等与Guan等的培养体系可发现，Zhang等采用的是富含表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的角质细胞无血清培养基和胚胎纤维母细胞培养基的等比例混合液，而Guan等采用的则是自制的包含碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)和EGF等生长因子的LMM101培养基[3]，因此可推测，所用培养基不同可能会造成USCs形态不同，但两种培养基所培养出的USCs在分化潜能上并无明显差异。

1.2 USCs的表面分子标志物 USCs属于成体干细胞的一种，除高表达c-kit、SSEA4、TRA1-60、Sox-2、Oct3/4等干细胞标志物外[4]，还具有间充质干细胞的特性，稳定表达CD73、CD90、CD105等间充质干细胞特异表面分子，不表达CD31、CD34、CD45等造血细胞表面抗原[5]，因此现多把USCs看做间充质干细胞的一种。

在Kang等[6]比较USCs与脂肪源性干细胞在细胞增殖、免疫调控及多向分化能力中的一项研究中[6]，他们所分离培养出的USCs形态呈“鹅卵石样、褶边”，类似于以前报道的尿路上皮细胞形态，而Zhang等[1]最初研究USCs时曾发现USCs表达尿路上皮特异性分子uroplakin Ⅰ a和细胞角蛋白7(cytokeratin 7，CK7)等，但进一步研究移植了男性供者肾脏的女性患者的尿液发现，其尿液中分离培养得到的USCs含有Y染色体，且高表达肾系标志物及肾脏脏层上皮细胞和壁层上皮细胞标志物，不表达肾小管上皮细胞、输尿管上皮细胞和尿道上皮细胞标志物，提示相比尿路上皮细胞，USCs更可能来源于肾脏[7]。

1.3 USCs的分化潜能 既往多项研究表明，在不同的培养基条件下，USCs可定向分化为三胚层各类细胞。在Guan等[2]的研究中，USCs在含胰岛素-转铁蛋白-亚硝酸盐、EGF、bFGF等成分的DMEM/F12培养基中，可被诱导分化为神经细胞，诱导后细胞表达神经细胞特异性蛋白巢蛋白、神经组织蛋白质s(S100)、神经丝蛋白(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，将用绿色荧光蛋白标记的诱导后细胞植入大鼠脑内后，发现绿色荧光阳性的细胞能迁移、分散到病变部位，细胞形态也由植入前的长梭形变成类似于星形胶质细胞的形态。

类似于间充质干细胞，USCs也具有良好的成骨、成脂分化能力。骨形成蛋白(BMP)被公认为具有诱导干细胞成骨的能力，高浓度BMP时USCs趋向于向成脂细胞分化，低浓度BMP时则更倾向于向成骨细胞及软骨细胞分化[2]。Bharadwaj等[5]通过BMP9诱导USCs向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞分化，并将诱导后细胞接种于裸鼠皮下，4周后可见骨样包块形成，病理切片证实为骨组织，Guan等[2]用BMP2诱导也得出了一致的结果。

Zhang等[1]最初研究USCs时曾认为USCs来自尿路上皮细胞，而Bharadwaj等[4]在富含血清及EGF的KSFM/EFM混合培养基中培养USCs，发现可将USCs定向诱导为尿道上皮细胞，诱导后细胞形态与尿路上皮细胞类似，绝大部分表达uroplakin Ⅲ、uroplakin Ⅰ a及CK7、AE1/AE3，经向尿路平滑肌诱导的USCs则可表达平滑肌分化特异性抗原smoothelin[5]，表明USCs可被诱导向尿路上皮细胞和尿路平滑肌细胞特异性分化。

有研究表明，采用含有血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的内皮细胞基础培养基培养USCs[5]或者经病毒转染使USCs过表达VEGF[8]，均可诱导USCs向血管内皮细胞分化，将诱导后细胞接种于Matrigel上离体培养，可发现细胞间形成管道状结构，且高表达CD31、vWF、KDR、FLT1、eNOS等内皮细胞特异性蛋白标志物[9]。在体内试验中，将含有诱导后细胞的Ⅰ型胶原凝胶植入裸鼠皮下，可发现诱导组广泛血管化并且大量表达内皮细胞特异性抗原[9]，证明USCs可被特异性诱导向内皮细胞分化，且可形成功能性结构。

2 USCs的永生化

在体外培养的人体正常细胞，在经过一段时间的分裂后，就会进入一种生长抑制状态，即衰老期(M1期)，经过转化的细胞可越过衰老期进入另一种增殖抑制状态，即危机期(M2期)，细胞开始逐渐出现退化并死亡，外源基因的稳定表达也会随着时间及细胞传代分化而被沉默或显著降低[11]，极大地限制了干细胞的来源。USCs也同样面临这样的问题。但在近期的研究中，温晟[12]通过运用hEFH启动猿肾病毒40大T抗原(SV40Tag)基因在USCs中表达，筛选获得的阳性细胞克隆扩大培养，得到永生化尿源性干细胞(iUSC)。USCs通常在传至8代左右开始萎缩死亡，而iUSC传代至50代仍生长旺盛。iUSC可在体外逃离M2期，获得无限增殖传代的能力，从而有助于外源基因在USCs稳定的高水平表达。实验证明，iUSC依旧表达CD73、CD44、CD106、SSEA4等干细胞表明标志物，具有成脂、成骨、成软骨分化特性，保持了干细胞分化潜能，且在裸鼠皮下注射4周内无肿瘤形成，初步证明无成瘤性。USCs永生化的成功为USCs在细胞移植治疗及组织工程学应用方面提供了新的稳定的细胞来源。

3 USCs移植与糖尿病肾病

大量研究证实，干细胞移植能在一定程度上有利于慢性肾脏病患者恢复肾功能[10]，其可能的机制主要有4种：(1)干细胞与肾脏细胞或结构的融合；(2)干细胞分泌的生长因子、细胞因子等活性物质有利于肾功能的恢复；(3)干细胞的免疫调节作用；(4)干细胞在肾脏环境内分化成为肾脏细胞[13]。

张超等[14]通过将USCs直接注射到慢性肾病模型大鼠肾脏皮质，在肾组织苏木素-伊红(HE)、Masson染色中发现，USCs组肾脏结构病理变化较安慰剂组轻，较健康对照组重，在胶原沉积方面，虽然USCs组仍高于对照组，但明显少于安慰剂组，肾脏间质炎性细胞浸润也得出同样结果。在术后的监测中，可发现术后2周时大鼠血肌酐开始出现明显下降，在第4周时达到一个稳定水平，同时肾小球滤过率(GFR)也在术后4周明显改善。术后12周追踪时发现有个别HLA染色阳性细胞(即USCs)与Bowman′s细胞融合，部分细胞分散在肾脏间质中，位于肾小管之间，提示USCs与肾脏组织结构的融合可能对肾功能恢复有一定作用。但同时不可忽视的是，在有关间充质干细胞移植的研究中，研究者们发现，不管是何种移植方式或移植手段，只有很少的移植间充质干细胞可以归巢到肾脏，而这也代表可能干细胞对肾脏的修复作用主要是靠旁分泌或者内分泌途径来实现的[15]。

糖尿病肾病是引起终末期肾病的常见原因之一，糖尿病肾病中蛋白尿的进展和足细胞凋亡密切相关，而既往研究表明，高糖可促进足细胞凋亡，减少足细胞骨架蛋白Synaptopodin的表达，从而促进糖尿病肾病的发生发展[17-18]。姜珍珍等[19]的体外试验证实，USCs主要依赖旁分泌作用发挥肾脏保护作用，不同剂量USCs的条件培养基能够减轻Synaptopodin的下调、抑制足细胞的早期凋亡。而进一步研究发现，USCs条件培养基中的外泌体可能是USCs在高糖环境中对足细胞起保护作用的重要物质。USCs来源的外泌体能减少体内外高糖导致的足细胞的凋亡与损伤[20]，同时能改善1型糖尿病大鼠尿微量清蛋白/肌酐，减少肾小球系膜增生，减少组织细胞凋亡，延缓糖尿病肾病的发生和进展。外泌体是一类介导细胞间遗传信息、蛋白质和脂质转移的微泡物质，不同细胞来源的外泌体膜上有特定的蛋白和脂质，通过特异性的受体配体结合作用，向细胞转移表面受体、蛋白和生物活性脂类，同时传递特定的mRNA和microRNA，从而通过旁分泌/内分泌途径实现对机体的调控。大量研究表明，外泌体能促进血管生成及抑制细胞凋亡[21-22]。在经过USCs来源的外泌体干预过的1型糖尿病大鼠肾组织中，TUNEL染色阳性细胞较单纯1型糖尿病组明显减少，且凋亡蛋白Bax和活性Caspase-3较单纯1型糖尿病组少，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达上调[16]，且通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测到，在USCs的条件培养基和USCs来源的外泌体中，BMP-7、VEGF、TGF-β1和血管生成素水平都较正常对照组显著升高[16]，而以上几种细胞因子均参与血管的生成。因此可推测，USCs来源的外泌体可能通过抑制Caspase-3的过表达及通过细胞因子如BMP-7、VEGF、TGF-β1等促进血管再生和细胞存活来减少足细胞的凋亡[16]，从而实现在糖尿病中保护肾脏的作用。

干细胞的免疫调节作用及在肾脏环境中可分化为肾脏细胞的能力已在大量的研究中得到证实[23-24]，间充质干细胞能通过抑制T细胞增殖、抑制B细胞的增殖和终末分化，以及影响树突状细胞的成熟和功能，同时联合参与其他免疫细胞的调节，从而改善糖尿病肾病的肾脏功能[20]。USCs与间充质干细胞有着类似的生物学共性，但目前大部分关于USCs的研究仍集中于其在组织工程学中的应用，USCs是否也具有免疫调节作用及在肾内能否分化为肾细胞，这些都有待更进一步的研究来揭示。

4 问题与展望

USCs由于其来源无创、方便，且有类似于间充质干细胞的生物学特性，有望成为糖尿病肾病等慢性肾脏疾病治疗中的新希望。现有研究结果也基本肯定了USCs在保护肾功能方面有明确效果，但目前研究多停留在初期阶段，主要研究对象是动物模型，还存在许多问题有待探究和解决：(1)USCs修复肾功能的机制仍不十分明确，是否参与了受损组织或器官的免疫应答，是否能在肾脏环境中分化为肾细胞？(2)USCs的移植方式、移植时机的选择对改善病情的影响尚不明确；(3)USCs联合多种干细胞移植是否会更好？(4)USCs移植的远期效果及安全性等问题亟待进一步的研究来验证。USCs在慢性肾脏病中的研究刚刚起步，随着对USCs研究的深入，相信USCs一定能在细胞治疗中发挥其巨大的作用。

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国家自然科学基金面上项目(81670684)。 作者简介：(1989-)，在读硕士，主要从事慢性肾脏病研究。△

，E-mail:zhkq2000@sina.com。

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