诺如病毒实验室诊断现状与展望

何涛君，陆学东，庞晓莉，汤一苇

诺如病毒实验室诊断现状与展望

何涛君，陆学东，庞晓莉，汤一苇

诺如病毒是引起非细菌性急性胃肠炎的主要病因，常常引起严重的公共卫生与食品安全问题。诺如病毒基因组的多样性及其它们不断的进化和变异为临床诊断及疫苗研制带来了挑战。本文就诺如病毒实验室诊断方法的研究进展作一综述，包括从传统经典的核酸检测到应用纳米、芯片等高新技术的多重核酸定量检测和高通量测序平台，以及体外成功培养的报道等等。这些新技术的成功运用将推动诺如病毒实验室诊断的新发展，以满足临床诊疗及疫苗研制的新需求。

诺如病毒；实验室诊断；多重核酸定量检测；高通量测序；病毒体外细胞培养

诺如病毒是一组小圆形（直径30～38 nm）、无包膜的单股正链RNA病毒，属杯状病毒科诺如病毒属。诺如病毒可分为7个基因组（GI～GVII组），40个基因型。GI、GII、GIV组主要引起人类感染，其中GI组有9个基因型，GII有22个基因型，而GIV仅有2个基因型[1-2]。在全球暴发流行的诺如病毒性胃肠炎中，85%以上是由感染不同的GII.4突变株所致，这也是造成散发性胃肠炎的最主要病因[3-7]。 2014年新发现的GII.17已超越GII.4成为2014—2015年中国冬季腹泻暴发流行的主流株[8]。GII.17也相继在非洲、亚洲、北美洲及南美洲有不同的散发性流行报道，其突变率明显高于2012年流行的GII.4 悉尼株[9-11]。一种基因的重组型（GII.16_GII.4 Sydney）最先在2015年底出现，继而在北美洲、欧洲及亚洲都有报道[12-14]。最新的一种基因重组型（GII.P16_GII.2的嵌合型）最早出现在2016年底，由德国人报道，并很快在北美洲及亚洲成为引起暴发性胃肠炎流行的主流株[15-17，43]。

诺如病毒感染是引起散发性和全球暴发流行性胃肠炎的最主要病因[18]。自1996年以来，诺如病毒引起了至少6个地区近50%～70%世界范围内胃肠炎的暴发流行[2]。随着轮状病毒疫苗在许多国家的预防接种，诺如病毒已迅速成为儿童及成人散发性胃肠炎的首要病因[18-20]。诺如病毒感染可导致易感人群患病率、住院率大大增加，甚至导致婴幼儿、老人及免疫缺陷患者死亡。因此，快速准确地鉴定病原对治疗患者，预防和控制院内感染及阻断社区暴发流行至关重要。自1972年Dr. Kapikian通过免疫电子显微镜首次发现并报道诺如病毒后的40年里，其实验室诊断经历了显著的变革和发展[21]。目前，PCR技术是实验室检测诺如病毒的最为敏感的方法，简单快速的免疫学检测方法由于敏感性低而应用受限，新型纳米技术为床旁检测提供了快速可靠的方法……总之，诺如病毒的实验室诊断技术的发展将以简化方法、降低成本、提高效益、结果精准为目标。

1 诺如病毒的表型及免疫学检测方法

电子显微镜下仅需少量样本并简单处理后，就可直观地从外形上将诺如病毒与多数病毒区分开来。但电子显微镜下区分小圆病毒的敏感性差，例如诺如病毒、札幌病毒及星状病毒的外形和大小极其相似，单纯电子显微镜观察尚无法区分三者。一项前瞻性研究对2486份粪便样本分析发现，有403份诺如病毒反转录PCR（RT-PCR）阳性的样本在电子显微镜下被漏检[22]。电子显微镜因保养维护成本及技术要求高，而对病毒的检出灵敏度低、特异性差，故不适用于临床。

自2003年以来，许多针对抗原的检测方法因其快速、低廉、操作程序简单而被广泛应用于诺如病毒抗原的检测[23]。常见的方法包括：传统的96微孔板的酶免疫测定（EIA）法、快速膜基免疫层析法以及生物素发光EIA法。目前，可应用的诺如病毒抗原检测方法仍然有限，其原因是缺乏可用于捕获及检测高变异诺如病毒的保守性抗原的特异性抗体。由于诺如病毒抗原具有高度多样性，对该检测方法的敏感度相对较低，但还是比电子显微镜的观察更为敏感。目前，正在开发的诺如病毒多种抗原检测的商品化试剂盒，大多仅具有体外诊断的欧洲CE标识，尚无法在美国使用。仅有一种出自德国拜发公司的第三代诺如病毒EIA检测试剂盒获得了美国FDA的初步鉴定，该方法可在病毒暴发流行期检测多个样本，但因其敏感度和特异性有限，目前仍然难以用于病毒胃肠炎的常规临床诊断[24]。对检测诺如病毒抗原的商业化EIA和免疫层析试剂盒进行的研究评估显示，这两种方法的灵敏度均低于RT-PCR对诺如病毒GI和GII的检测结果[25]。

2 以核酸为基础的诺如病毒检测

自1990年以来，以核酸为基础的RT-PCR技术是诺如病毒实验室诊断的金标准[1，26]。该方法极其灵敏，能快速准确的检出临床样本中的病毒[22]。但是临床上解释诺如病毒核酸阳性结果较为复杂，因为存在无症状病毒携带者，特别是接受了器官或骨髓移植的患者[27-29]。因此无法评估这类患者在病毒感染传播中的作用以及是否需要对其作为感染源危险人群实施控制和监测。以核酸为基础的检测主要用于流行病学病因的检测以及医院内感染的的鉴别和感控的随访。

2.1 常规RT-PCR技术（cRT-PCR） cRT-PCR是指在核酸的扩增过程中，其扩增产物可以累积，并在进行检测或分析前随着热循环的完成或终止时达到平台。这类PCR产物通常采用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行长度判别，从而检测扩增的PCR产物。Jiang等[30]于1992年首次采用cRTPCR技术鉴定并报道了诺如病毒感染。cRT-PCR主要的缺陷在于步骤繁杂、劳动强度大且耗时长；产量低、变异率高；扩增产物须要置于开放体系中操作，污染风险高。由于设计了型特异性引物，使得cRT-PCR已广泛应用于确定诺如病毒进化的分子流行病学调查。对PCR扩增产物测序已广泛应用于研究诺如病毒株的基因变异，及暴发流行的调查研究。

2.2 等温扩增技术 核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sequence-based ampli fi cation, NASBA） 技术和环介导等温扩增（loop-mediated isothermal ampli fi cation,LAMP）技术均属于等温扩增法，可用于检测粪便样本中的诺如病毒。该方法的优点为单一温度条件下的扩增，无需热循环仪，类似实时PCR，且敏感性极高。NASBA技术可用于检测诺如病毒RNA，但其特异性还没有达到临床诊断的要求，由于在相对较低的温度条件下（-40℃）扩增病毒RNA时，其特异性会随之降低。LAMP技术的优势在于检测速度快、操作简便，反应在单管中进行，且反应时间少于1 h。通常温度要求在60～65℃，无需大型设备，只需简单的加热器或水浴即可。结果的判读只需直观的观察浑浊度或采用浊度阅读器，也可添加金属荧光指示剂来提高浊度的可读性。LAMP技术已应用于检测GI和GII型诺如病毒，可提供与实时荧光定量反 转 录PCR（real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR）相当的检测结果。近来商业化的诺如病毒GI和GII型LAMP试剂盒已被日本Eiken Chemical公司开发，其敏感性高于实验室开发的LAMP技术[31]。未来LAMP技术将作为可选择性、快速准确的检出诺如病毒的方法之一。

2.3 qRT-PCR技术 该技术的原理是通过非特异性荧光染料偶联到目标特异性探针上，实时检测特异性的核酸生成，且每一轮PCR循环后均可检测扩增产物。诺如病毒开放性读码框ORF1/2连接区是其最保守的基因区，该区域的靶向引物可用于实时检测诺如病毒不同基因型并具有高度敏感性。针对诺如病毒个体基因组的特异性引物（GI和GII），现已开发出具有高敏感性且能分型诺如病毒的多重qRT-PCR技术，能广谱地检测许多基因型的诺如病毒，包括新近报道的GII.17型突变株[1，8，11，32]。尽管如此，基于保守区设计的引物和探针不能确保对突变株检测的均一敏感性。由于存在不可预测的单核苷酸的多态性[33]，因此，设计的引物和探针应当适当进行调整以满足检测所需。Pang等[26]设计了针对诺如病毒GI和GII的特异性引物，构建了多重qRT-PCR技术用于区分并检测不同基因组的诺如病毒。多重检测技术将检测时间缩短了至少50%，并降低了试剂成本，从而提高了检测效率。目前已开发的包含引物和探针的LightCyclerq RT-PCR技术检测GIV型诺如病毒，已在全球特别是北美的临床型和研究型实验室得到了广泛应用[29，34-36]。近来出现了许多诺如病毒实时定量检测的商业化试剂盒，经应用证实只有少数有较为可靠和满意的检测结果：RIDAGENE（德国）针对诺如病毒I和II型的qRT-PCR技术能广谱测定各型的诺如病毒感染情况，并具有很好的敏感性和特异性[25]。

在对诺如病毒的前期研究中，我们采用Pang等[22，26]构建的qRT-PCR技术分型检测肿瘤患者粪便中的诺如病毒感染情况，并与目前FDA认证的Luminex多重检测技术进行了平行对比，一致率达到100%。所有标本我们都进行了重复性实验，同时做了组内及组间的对比实验，其组间的变异CV=2.42%，组内的变异 CV=0.83%，提示了Pang等构建的荧光定量PCR技术在组内及组间具有非常高的精密度和准确度。在对患肿瘤的免疫缺陷病人检测中，我们发现诺如GII型的感染率及病毒载量明显高于GI型。在对临床资料的多因素分析中，我们发现感染GII的患者呈现出更为严重的临床症状。

2.4 多重PCR检测技术 基于固相或悬浮芯片的多重PCR检测技术，为临床多种病原的快速筛查带来了便利。目前采用的寡核苷酸芯片技术以固相载体为支持的膜芯片，虽检测信息量大，但受表面张力、空间效应等影响重复性不好，无法定量检测。Luminex公司开发的多指标同步分析功能的芯片技术也称为液态芯片或悬浮芯片，可实现对一份微量样品同时进行多达100种不同分析指标的检测，具有快速、操作简单、灵敏度高、重复性好、高通量等优点。Zhang等[36]回顾了两个商业化的多重检测技术平台，Luminex公司（美国德克萨斯州，奥斯汀）开发的胃肠道病菌检测系统（GPP）和BioFire公司（美国犹他州，盐湖城）开发的薄膜阵列式胃肠检测系统（GI Panel）都可以用于检测GI和GII型诺如病毒，据报道上述两种方法比传统的多重检测方法的灵敏度更高。这些全封闭的自动化系统，在鉴别散发性或暴发流行性胃肠炎的多种复杂病原体方面展现了巨大的潜能：处理样本仅需2～5 min，上机时间少于1 h[37]。这些将有助于临床医生作出迅速的判断和临床干预，已期达到有效控制感染传播的目的。2.5 基因分析检测 基因分型有助于更好的理解诺如病毒的基因进化、分类和分子流行病学特征，多应用于研究机构和公共健康实验室。人类诺如病毒可分为不同的基因组、基因型及突变株。因其基因组的高度多变性，基因分型多需要结合RTPCR扩增后的产物进一步测序鉴定。根据基因组A～E区的5个不同区域可以对诺如病毒基因分型。最新研究发现基于C～E区设计的外壳蛋白基因引物用于分型有独特之处，因为病毒的外壳蛋白直接反映了宿主-受体相互作用、免疫应答及相关的基因突变信息[3，5]。就目前的认识而言，诺如病毒基因分型的金标准是VP1外壳全基因测序。但由于临床样本中的病毒携带量较低，扩增并测序部分病毒外壳序列进行分型比全外壳序列更具有可操作性。Hasing等[38]报道基于开放性读码框ORF1/2连接区设计的引物可以更好的鉴定发生了抗原漂移的诺如病毒。目前，与诺如病毒胃肠炎相关的至少有40种基因型，可归为两大基因组（GI和GII）。

2.6 高通量测序 下一代基因测序（即高通量测序）技术已从研究领域逐步进入应用和诊断领域。因其具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势而被广泛应用于基因组学的研究。诺如病毒的基因组全长7500 bp，相对较小，采用全基因测序将是研究诺如病毒的新方法。最新的基因测序扩增子文库给研究者提供了快速扩增诺如病毒基因组不同区域的基因信息，采用此方法，成千上万个扩增子可同时生成并用于检测[39-42]。高通量测序可使研究者在单个实验中同时分析感兴趣的全部基因信息。随着测序技术的发展，高通量测序可从临床样本中鉴定诺如病毒的常见株及突变株。并可追踪诺如病毒的基因进化和发现新突变株，潜在的预测诺如病毒胃肠炎的暴发流行。目前高通量测序多应用于研究型实验室，随着标准化试剂和监测系统的研发，该技术将会在不久的将来被诊断型实验室所采用。

3 结论及展望

当前用于检测诺如病毒的方法都存在一些优缺点，没有一种方法堪称为完美无缺。每个实验室应结合自身的需求和目的（诊断或研究），实验室背景（参考性或地方诊断性实验室），仪器及专业性技术的需求等来选择合适的检测方法。诺如病毒的免疫学方法检测主要用于监测可疑的诺如病毒性胃肠炎的暴发流行，由于其灵敏度低而不推荐用于常规的诊断实验室。qRT-PCR技术是检测粪便、食物及环境中诺如病毒的最佳方法。尽管如此，由于诺如病毒的基因型多样性和持续的基因进化，当仅采用单对特异性引物扩增时，容易出现假阴性结果。设计能靶向诺如病毒不同基因组区域的多元引物集簇的方法可以提高病毒的检出率。此外，还可以利用已知诺如病毒家族成员序列变异的简并引物进行扩增检测。一些新技术如以LAMP技术，纳米技术为基础的多重检测平台和高通量测序系统已发展成为研究机构检测诺如病毒的主要方法，期待在不久的将来把这些新技术、新方法运用到诊断实验室中去，以满足服务临床，精准诊疗的新需求。

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Laboratory diagnosis of norovirus: present and future

HE Tao-jun*, LU Xue-dong, PANG Xiao-li, TANG Yi-wei
Laboratory Department, Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Shenzhen 518033, China

Norovirus is recognized as the primary cause of nonbacterial acute gastroenteritis and often causes serious public health and food safety concern. Fast evolution and continuous drifting of norovirus genome have posed challenges for clinical diagnosis and vaccine development. This review updates the research of laboratory diagnosis of norovirus, from classic nucleic detection to recent application of nanotechnology and chip, such as a multiplex RT-qPCR detection and high-throughput sequencing. A very recent breakthrough in cell culture of norovirus in vitro is also introduced. The latest advance of technology improves the laboratory diagnosis of norovirus, thus meeting the requirement of clinical diagnosis and vaccine development.

norovirus; laboratory diagnosis; multiplex RT-qPCR; high-throughput sequencing; in vitro cell culture

R373

A

1007-8134(2017)05-0265-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.05.005

美国NIH科研基金（P30 CA008748）

518033 深圳，中山大学附属第八医院检验医学部（何涛君、陆学东）；T6G 2J6 加拿大埃德蒙顿，阿尔博塔省立公共卫生实验室（庞晓莉）；阿尔博塔大学医学院医学实验和病理学系（庞晓莉）；10021 纽约，美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心（汤一苇）

何涛君，E-mail： htjjocelyn@126.com

*Corresponding author, E-mail: htjjocelyn@126.com

（2017-09-17收稿 2017-10-09修回）

（本文编辑 赵雅琳）