三萜皂苷提取分离技术的研究进展

聂 佳，刘克明，刘永平，佟继铭，杨明明

（承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000）

综述讲座

三萜皂苷提取分离技术的研究进展

聂 佳，刘克明，刘永平△，佟继铭，杨明明

（承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000）

三萜皂苷；提取；分离

三萜皂苷(triterpenoid saponin)是一类具有显著生物活性的物质，在自然界中分布较为广泛，在双子叶植物中分布最多，尤其在五加科、豆科、七叶树科、报春花科、无患子科、桔梗科、远志科、茶科等植物中含量较为丰富。三萜皂苷主要由糖和三萜皂苷元组成，具有较广泛的药理作用，尤其在抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、降血糖、防治心脑血管疾病等方面具有显著效果。本文总结了近年来三萜皂苷分离精制的常用方法，为三萜皂苷的分离精制提供参考依据。

1 三萜皂苷类化合物的提取方法

目前，三萜皂苷类化合物的提取主要是醇法和水醇法。醇法：甲醇或乙醇提取，然后回收溶剂，再用乙醚脱脂后用水饱和的正丁醇萃取。水醇法：首先水回流提取，然后提取液浓缩,加乙醇沉淀多糖、多肽等大分子杂质，再用水饱和的正丁醇萃取[1]。

2 三萜皂苷类化合物分离精制的方法

三萜皂苷类化合物分离精制主要是应用色谱法，色谱技术由于分离效率高、操作简单等已成为高纯天然产物制备的主要方法。目前，实验室常用的色谱技术按形式可分为薄层色谱、柱色谱和逆流色谱。

2.1 薄层色谱 薄层色谱根据各组分的吸附性能和分配系数的差异达到分离的目的，是一种简单、快速、微量的分离方法，可直接使用样品的粗提物，且显色方法多样，图像易于保存，能同时分离多个样品，通常用作柱色谱分离条件的探索，摸索柱色谱的洗脱条件。有研究显示，以齐墩果酸作为对照品，对野生大豆皂苷进行薄层层析测定皂苷含量，结果显示野生大豆皂苷至少还有9个部分在1-5μg范围内呈良好的线性关系，平均回收率达98.98%，RSD值为0.41%，薄层层析斑点清晰，且分离良好，该方法简单准确，结果可靠稳定[2]。对于一些在薄层色谱板上分离度比较好的化合物,可以通过适当增加薄层色谱板吸附剂的厚度，采用制备型薄层色谱(PTLC)分离单体，通过增加上样量，可用来分离毫克级的样品，该方法不仅所需资金少，设备简单，且能制备纯度较高的皂苷。刘飞等[3]采用制备型薄层色谱技术对人参皂苷Rg2(组)混合皂苷进行分离，从50mg Rg2(组)皂苷中获得20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg6及Rg4等4种皂苷，含量分别为2.6mg、2.8mg、1.5mg及3.9mg，纯度分别为95.3%、96.4%、96.3%及98.3%。

2.2 柱色谱 柱色谱因操作简单、成本低廉得到了普遍应用，目前实验室应用较多的是硅胶柱色谱法和压力液相色谱法。

2.2.1 硅胶柱色谱：硅胶柱色谱的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。由于硅胶色谱柱填充剂的量远远大于薄层板，因而硅胶柱色谱可用于分离量比较大（克数量级）的物质。目前一般选用CHCl3-CH3OH-H2O混合液作为硅胶柱层析的洗脱剂，多用于分离一些差别比较大的化合物。有研究显示，采用氨基封尾的单分散聚合硅胶柱层析法对三七总皂苷进行分离，得到三七皂苷R1、人参皂苷Rb1组合物的纯度为95.3%，此法提纯皂苷单体简单、高效、实用[4]。有研究用体积比为9.5:0.5和9:1的氯仿-甲醇洗脱液对5g绞股蓝总皂苷使用硅胶柱色谱法进行分离，得到3种绞股蓝皂苷单体组分，得率分别为2.6%、3.0%和5.2%，纯度分别为88.73%、93.11%和78.54%[5]。还有研究以体积比为8.5:1.5的氯仿-甲醇溶液为流动相对25g三七总皂苷采用硅胶柱色谱法进行分离，得到人参皂苷Rh1单体0.36g，得率为1.44%，纯度为66.08%[6]。

2.2.2 压力液相色谱：压力液相色谱中，目前使用最多的是高效液相色谱法，高效液相色谱法使用硅胶、反相硅胶或其它碳水化物作为色谱柱填料，可快速分离皂苷，而且只需要几十微克纯品就可以对某些简单的皂苷进行结构鉴定。相对于薄层色谱可同时分离多个样品，高效液相色谱每次只能分析一个样品，且对样品制备要求较高，然而与常规柱色谱相比，高效液相色谱填料更加精细、柱效高、分析速度快、自动化程度高，在实际操作中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留值和选择性，从而使不同样品得到分离。有研究者使用高效液相色谱采用梯度法，以乙腈水溶液为流动相，分离了人参中6种主要的人参皂苷，并采用紫外检测器进行检测，检测波长203mm，该方法在25mg/L-30mg/L的范围内有良好的线性关系，回收率高于80%[7]。谭洪根等[8]使用Kromasil ODS柱，以乙腈-水(30:70)作为高效液相色谱的流动相，检测波长为212nm，分离检测了续断皂苷VI的提取物，本方法具有很好的分离效果，线性范围为0.5825-9.32μg，R=0.9999，平均回收率和重复性RSD分别是100.3%和2.3%。在分离制备比较复杂样品、微量样品或极性较小的样品时，可采用反相高效液相色谱法，能达到较好的分离效果。陆娟等[9]采用RP-HPLC法检测生脉注射液中7个人参皂苷类成分的含量，使用Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以乙腈-水为流动相梯度洗脱，发现7个人参皂苷类成分之间有良好的分离度，各组分的浓度和相应峰面积之间呈现良好的线性关系，精密度、重复性及加样回收率的RSD均小于3%。有研究显示，采用亲水/反相二维色谱可制备出桔梗中的两个三萜皂苷单体，经鉴定为deapi-platycoside E和platycoside E，纯度均达到90%以上[10]。

2.3 逆流色谱 逆流色谱的原理是基于样品在旋转螺旋管内互不混溶的两相溶剂间因分配系数的不同而分离，无需任何载体或支撑体，能在短时间内实现高效分离和制备，并可以达到几千个理论塔板数，且分离量较大，一次进样可达几十毫升，一次可分离近10g的样品。基于这一优点，与柱色谱相比，它能有效克服固定相带来的样品吸附、损失、污染和峰拖尾等缺点。逆流色谱分离萜类物质时，一般选用氯仿-甲醇-水或正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水为流动相。吴永慧[11]发现，高速逆流色谱不仅能高效、完全分离大豆皂苷粗提物，并且能分离得到大豆皂苷单体。有研究显示，采用醋酸乙酯-正丁醇-水-醋酸(4:1:3:0.02，V:V:V:V)作为高速逆流色谱的溶剂系统去离人参中的人参皂苷，流速为1.5ml/min，仪器转速为950r/min，检测波长254nm，分离得到3个单体皂苷和一个混合物组分，单体皂苷的纯度经高效液相色谱检测均高于95%[12]。分离制备人参皂苷Rg1、Rf及Rd时，可采用洗脱-推挤逆流色谱技术，以乙酸乙酯-正丁醇-0.1%甲酸水(2:1:3，v/v)为溶剂系统，上相为固定相、下相为流动相，操作体积流量为40ml/min，切换体积为2400ml，以此为条件，从300mg样品中分离纯化得到71mg人参皂苷Rg1、21mg人参皂苷Rf和53mg人参皂苷Rd，纯度分别达到96.2%、94.3%和95.1%[13]。但高速逆流色谱一次分离所需要的时间较长(以小时计)，对样品进行分离的两相溶剂的分配系数一般是根据实验积累的经验，没有充分的理论依据，因此，在这方面高速逆流色谱还需要进一步完善。

2.4 其它方法 随着提取分离技术的不断进步，不断涌现出三萜皂苷类化合物分离的新方法。利用活性炭可以选择性地吸附除人参皂苷Re(G-Re)以外的其它种类的皂苷，可分离和纯化人参花芽中的人参皂苷Re[14]。目前，为提高皂苷分离的纯度，大多采用几种分离方法相结合的方法，以便充分发挥各方法的优势。有研究显示，使用薄层色谱和高效液相色谱技术相结合的方法，对苜蓿皂苷进行分离检测，首先使用甲醇溶液萃取苜蓿总皂苷，以氯仿-甲醇-水(65:35:10，下层)做薄层色谱的展开剂，将甲醇萃取液经薄层色谱分离，然后收集不同比移值的分离组分，再将分离后的组分用高效液相进行检测，色谱柱为Venusil Mp C18柱(2)(4.6mm×250mm)，流动相为甲醇-水(15:85)，检测波长为200nm，结果显示，苜蓿总皂苷经薄层层析后分离得到5种皂苷化合物，再经高效液相色谱法进一步分离，可得到单体苜蓿皂苷13种[15]。有研究使用高速逆流色谱结合凝胶柱层析分离一200mg的人参皂苷浓缩样品，以溶剂配比为醋酸乙酯-正丁醇-水(4:1:6，V:V:V)作为高速逆流色谱的溶剂系统，得到单体52.6mg的Rg1、37.2mg的Re，纯度分别为99.3%、98.2%，总回收率分别为82.4%、84.4%[16]。

对于人参茎叶总皂苷进行分离纯化，可采用硅胶柱色谱及高效液相色谱等相结合的方法，使用NMR、MS等方法进行单体的化学结构鉴定，结果分离鉴定了39个化合物，其中有一个是新化合物[17]。

对于从西洋参总皂苷中分离制备人参皂苷单体，可采用正相硅胶柱层析结和反相SG-64制备色谱柱，以三氯甲烷-甲醇为流动相对硅胶柱色谱进行梯度洗脱，以甲醇-水为流动相对反相SG-64制备色谱进行梯度洗脱，分离得到6个纯度超过95%的人参皂苷单体，鉴定为人参皂苷Rg1、人参皂苷La、人参皂苷Rg2、人参皂苷Re、拟人参皂苷P-F11、人参皂苷Rd[18]。

有研究表明，采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱结合反相色谱的方法研究金铁锁根皂苷的化学成分，分离鉴定了三个化合物，发现化合物1为新的三萜皂苷类化合物，并且化合物2、3为首次从该属植物中分离得到[19]。

3 展望

三萜皂苷作为一类具有显著生物活性的物质，在自然界中分布较为广泛，其提取分离技术的发展对其药理作用的研究至关重要。三萜皂苷常用的提取分离方法不少，但无论采用哪种方法，都存在自身的局限性，纯度都不能达到最高。从目前的研究看，采用相适宜的多种分离方法相结合的方式，能充分发挥各自的优势和长处，弥补不足，从而使三萜皂苷单体的分离纯度更高。但三萜皂苷类化合物的结构复杂，单体种类更是繁多，如何选择合适的分离方法以使分离效率达到最高，分离方法更加简化，提取时间更短，有机试剂的使用更少，对环境的污染更小，还需要研究人员进一步的分析探讨。

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R284.2

A

1004-6879（2017）03-0235-03

2016-10-10）

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