固相萃取-在线光化学衍生-荧光检测法同时测定辣椒制品中4种苏丹红染料

王韦岗，唐双双，陆源，朱新生

（镇江市产品质量监督检验中心，江苏镇江 212132）

固相萃取-在线光化学衍生-荧光检测法同时测定辣椒制品中4种苏丹红染料

王韦岗，唐双双，陆源，朱新生

（镇江市产品质量监督检验中心，江苏镇江 212132）

建立了固相萃取-在线光化学衍生-荧光检测法同时测定辣椒制品中苏丹红 Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的方法。用丙酮和乙腈的混合溶液（2∶8）提取样品中4种苏丹红染料，提取液浓缩后经C18固相萃取柱净化，采用高效液相色谱进行分离，在线光化学衍生后进入荧光检测器测定，外标法定量。结果表明：4种苏丹红在0.10～1.0μg/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999；低、中、高3个不同加标浓度下，4种苏丹红的回收率均大于85%，相对标准偏差为1.58%～4.36%；方法的检出限（LOD）为0.30～0.45μg/kg，定量限（LOQ）为1.00～1.50μg/kg。该方法具有重现性好、灵敏度高、结果准确的特点，适用于食品中苏丹红残留的分析检测。

固相萃取；光化学衍生；高效液相色谱；荧光检测法；苏丹红

苏丹红（Sudan dyes）又名油性红、溶剂红，是一类以苯基偶氮萘酚为主要基团的人工合成色素，主要用于石油、机油等工业溶剂中，起到增色作用［1］。由于用苏丹红染色后的食品颜色鲜艳且不易褪色，一些不法食品企业把苏丹红作为色素添加到食品中，然而这类化合物在降解过程中会产生苯胺和萘酚，具有致突变性和致癌性［2－4］，对人体的肝肾器官具有明显的毒性作用，我国以及欧盟严令禁止其作为色素在食品中使用［5］。

国家标准GB/T 19681－2005采用高效液相色谱-紫外法测定食品中的苏丹红［6］，该方法灵敏度较低，在测定时需要切换扫描波长，不利于操作。荧光检测法具有选择性好、灵敏度高、检出限低等优点，在分析科学及其他相关领域的应用越来越多［7－10］，而苏丹红的荧光响应较低，以荧光检测法测定时需要对其进行衍生，转变为具有较强荧光响应的化学结构，因此开展研究苏丹红分子的荧光性质，利用其荧光现象建立苏丹红的检测新方法具有重要的实际意义。本文采用C18固相萃取柱对样品进行浓缩、净化，建立了高效液相色谱分离-在线光化学衍生-荧光检测法同时测定辣椒制品中苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的方法，该方法具有重现性好、灵敏度高、结果准确的特点，适用于食品中苏丹红残留的分析检测。

1 材料与方法

1.1 仪器及设备

Waters e2695高效液相色谱仪（主要包括2475荧光检测器、柱温箱、自动进样器等）；光化学衍生器（由紫外灯、聚四氟乙烯反应管组成） 北京华安麦科生物技术有限公司；超生波清洗器；离心机；旋转蒸发器；氮气吹干仪；Millpore超纯水系统；CNWBOND HC-C18（500mg/6mL）固相萃取柱 上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 试剂

乙腈、甲醇和丙酮：色谱纯，美国Tedia公司；无水硫酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水：Millpore超纯水。

标准物质：苏丹红Ⅰ（纯度≥99.0%），苏丹红Ⅱ（纯度≥99.0%），苏丹红Ⅲ（纯度≥96.0%），苏丹红B（纯度≥90.0%） 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.3 分析测定条件

色谱柱：CNW Athena C18－WP（250mm×4.6mm，5μm）；流动相A为乙腈，B为甲醇，梯度洗脱：0～11min，100%A；11～12min，100%A～0%A，0%B～100%B，12～25min，100%B；流速：0.8mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；荧光检测器：激发波长310nm，发射波长348nm。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品的提取

称取2.0g试样于50.0mL离心管中，加入5.0g无水Na2SO4，20.0mL丙酮-乙腈（2∶8）溶液，超声提取20min，以5000r/min离心5min，将上清液转移至250mL鸡心瓶中，残留物用20.0mL丙酮-乙腈溶液重复提取1次，合并上清液，并在40℃水浴中减压旋转蒸发浓缩至约1mL，待净化。

1.4.2 固相萃取柱富集净化

C18固相萃取柱依次用5mL乙腈、5mL水进行活化和平衡，然后将上述待净化液上样过柱，用1mL丙酮-乙腈溶液润洗鸡心瓶，并将润洗液转移至固相萃取柱中，用5mL水淋洗，再用5mL丙酮-乙腈溶液进行洗脱，收集全部洗脱液，氮气吹干，用丙酮-乙腈溶液重新定容至1mL，经0.45μm滤膜过滤后进样分析。

1.5 标准溶液的配制

分别准确称取一定质量的苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B，加入少量丙酮超声溶解后转入100mL容量瓶中，用乙腈稀释成浓度为0.10mg/mL的标准储备液，放置于4℃冰箱中避光保存。临用前，分别准确吸取一定体积的0.10mg/mL标准储备液，用乙腈逐级稀释到相应浓度的混合标准溶液。

2 结果与讨论

2.1 扫描波长的选择

采用Waters 2475荧光检测器自带的3D扫描功能分别在波长200～340nm，330～600nm范围内扫描4种苏丹红光化学衍生产物的激发波长和发射波长，扫描结果见图1。

图1 4种苏丹红光化学衍生产物的（a）激发光谱和（b）发射光谱图Fig.1（a）Excitation and（b）emission spectra of Sudan dyes after irradiation

由图1可知，苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B经光化学衍生后其衍生产物的最佳激发波长分别为312，312，305，305nm；最佳发射波长均为348nm，因此本文选择激发波长310nm、发射波长348nm作为扫描波长对4种苏丹红进行同时测定。

2.2 检测方法的选择

分别采用荧光检测器和柱后光化学衍生-荧光检测器对相同浓度的4种苏丹红混合标准溶液进行测定，测定结果见图2。

图2 光化学衍生前（a）、后（b）4种苏丹红混合标准溶液色谱图Fig.2Chromatogram of the standard solution of Sudan dyes（a）before and（b）after irradiation

由图2可知，采用荧光检测器测定时，4种苏丹红仅表现出微弱的荧光响应，不利于痕量组分含量的测定；经光化学衍生后，4种苏丹红的荧光响应大为增加，这是由于苏丹红是一类萘酚偶氮结构型染料，其分子结构中的偶氮基团具有光化学活性，在光照作用下能够发生顺式和反式结构的互变［11］，甚至能够与溶剂发生光化学反应，从而导致偶氮化合物的性质发生显著的变化，生成具有较强荧光响应的物质。

2.3 流动相的选择

分别以乙腈、甲醇、乙腈-水（98∶2）、甲醇-水（98∶2）、乙腈-甲醇（98∶2）为流动相等度洗脱，光化学衍生后测定，考察4种苏丹红的出峰及分离情况，结果见图3。以乙腈为流动相时，4种苏丹红均能产生较强的荧光响应，且4种苏丹红具有很好的分离度；以甲醇为流动相时，苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ仅有微弱的荧光响应，响应值较低，难以满足苏丹红残留的检测要求，苏丹红Ⅲ和苏丹红B具有较强的荧光响应，与乙腈为流动相相比其响应值更高；以乙腈-水（98∶2）、甲醇-水（98∶2）、乙腈-甲醇（98∶2）为流动相时，苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ的荧光响应均较弱，与未发生光化学衍生反应测定的响应值相近。上述实验表明：苏丹红的光化学衍生反应及反应产物的荧光性质与参加反应的溶剂相关，苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ在纯乙腈条件下才能发生光化学衍生反应，当流动相中含有微量的水和甲醇时都会影响其光化学反应；苏丹红Ⅲ和苏丹红B与甲醇和乙腈均能发生光化学反应，微量的水不影响这两者的光化学反应，而且在甲醇流动相中两者的光化学衍生产物的荧光响应值更高，主要原因是随着苏丹红Ⅲ和苏丹红B分子结构中共轭体系的增大，分子极性减弱，从而在极性较弱的甲醇中表现出更强的荧光强度［12］。因此，分别选择乙腈和甲醇为光化学反应的溶剂，采用梯度洗脱的方法对4种苏丹红进行分离和测定。

图3 流动相对4种苏丹红光化学衍生及分离度的影响Fig.3Effects of mobile phase on photochemical derivatization and resolution

2.4 样品前处理条件的选择

现有的国家标准测定苏丹红时通常采用乙腈直接提取或者氧化铝层析柱净化的方法进行样品前处理［13，14］，而前者容易受到样品基质的影响，提取后存在大量的干扰物质，影响目标物质的定性和定量；后者处理方法较为繁琐，氧化铝的活性对方法回收率的影响很大。空白样品和加标样品采用C18固相萃取柱净化后测定的色谱图见图4。

图4 （a）空白样品（b）加标样品的色谱图Fig.4Chromatogram of（a）blank sample and（b）condiment sample spiked with Sudan dyes

由图4可知，C18固相萃取柱对4种苏丹红具有很好的保留作用，以水为淋洗液可以一次性去除样品中大部分水溶性干扰物质，减少杂质对苏丹红检测结果的影响，同时采用C18固相萃取柱进行样品前处理，对待测组分还具有浓缩和富集的作用，有利于降低待测组分的检出限。

2.5 标准曲线、线性范围及检出限

分别准确吸取适量体积的苏丹红标准储备液，用乙腈逐级稀释成一定浓度的混合标准溶液，按上述优化的实验条件进行测定，以峰面积（y，μV·s）对质量浓度（x，μg/mL）作图，所得线性回归方程、线性范围和相关系数（R2）见表1。向阴性火锅底料样品中添加低浓度水平的苏丹红混合标准溶液，按照上述方法进行样品前处理后上机检测，以S/N＝3为检出限（LOD），S/N＝10为定量限（LOQ），结果见表1。

表1 方法的线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限（LOD）和定量限（LOQ）Table 1Linear ranges，regression equations，correlation coefficients，limits of detection and limits of quantitation of the method

由表1可知，采用外标峰面积法定量，4种苏丹红在相应的浓度范围内均具有良好的线性关系，相关系数（R2）大于0.999。与国标方法相比，可较好地减少样品浓缩、净化等样品前处理过程带来的误差，该方法线性范围宽，检出限低，可满足实际样品的检测。

2.6 回收率和精密度

向阴性火锅底料样品中分别加入低、中、高3种质量浓度的苏丹红混合标准溶液，并以上述实验方法进行样品处理和测定，考察实验方法的回收率，并对加标样品重复测定6次，考察实验方法的精密度。回收率和精密度结果见表2。

表2 样品中苏丹红加标回收率和精密度实验结果（n＝6）Table 2Recoveries and relative standard deviations of Sudan dyes in condiment（n＝6）

由表2可知，苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的回收率均在85%以上，相对标准偏差（RSD）为1.58%～4.36%。

3 结论

本文以C18固相萃取柱净化样品，富集苏丹红染料，并基于紫外光照射能够增强苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，B的荧光响应，建立了固相萃取-在线光化学衍生-荧光检测法同时测定辣椒制品中4种苏丹红染料的方法。该方法能够有效去除样品中杂质干扰，具有重现性好、灵敏度高、结果准确的特点，适用于食品中苏丹红残留的分析检测。

［1］国占生，刘保生，赵风利，等.荧光淬灭法快速测定食品中苏丹红Ⅰ的含量［J］.食品研究与开发，2009，30（12）：131-133.

［2］于林，孟冰冰，杨桂玲.辣椒制品中的苏丹红检测方法的优化［J］.中国调味品，2014，39（7）：123-125.

［3］中华人民共和国卫生部.苏丹红危险性评估报告［R］.北京：中华人民共和国卫生部，2005.

［4］王峰，黄薇，唐波，等.混合胶束对苏丹红Ⅰ的荧光增强作用及其分析应用［J］.化学试剂，2010，32（2）：139-143.

［5］刘正才，杨方，尹太坤，等.固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法同时测定禽蛋中4种苏丹红染料残留量［J］.分析测试学报，2015，34（2）：171-176.

［6］GB/T 19681－2005，食品中苏丹红染料的检测方法［S］.

［7］刘珺，弓振斌.高效液相色谱-柱后在线光化学衍生荧光检测法测定辣椒油中4种苏丹红染料［J］.色谱，2012，30（6）：624-629.

［8］陈万勤，黄丽英，陈小珍，等.高效液相色谱光化学在线衍生技术在11种磺胺药物残留检测中的应用［J］.分析化学，2014，42（4）：573-578.

［9］周尚，杨季冬，贺奎娟，等.荧光光谱法测定食品中苏丹红含量［J］.理化检验，2013，49：179-182.

［10］陈章捷，陈金凤，张艳燕，等.全自动固相萃取-高效液相色谱荧光法测定蜜饯中人工合成甜味剂对乙氧基苯脲含量［J］.中国调味品，2014，39（3）：112-114.

［11］蔡其洪，邹哲祥，李耀群，等.同步荧光法同时测定苏丹红Ⅱ和苏丹红Ⅲ［J］.高等学校化学学报，2007，28（9）：1163-1665.

［12］蔡其洪.苏丹红染料荧光性质及分析方法的研究［D］.厦门：厦门大学，2008.

［13］GB/T 29663－2013，化妆品中苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的测定高效液相色谱法［S］.

［14］NY/T 1258－2007，饲料中苏丹红染料的测定高效液相色谱法［S］.

Determination of Four Sudan Dyes in Chili Products by HPLC with On-line Photochemical Derivatization and Fluorescence Detection

WANG Wei-gang，TANG Shuang-shuang，LU Yuan，ZHU Xin-sheng
（Zhenjiang Center for Products Quality Supervision and Inspection，Zhenjiang 212132，China）

A method for the measurement of Sudan I，SudanⅡ，SudanⅢand Sudan B in chili products using high performance chromatography（HPLC）with on-line photochemical derivatization and fluorescence detection has been developed.The four kinds of Sudan dyes in samples are extracted by acetone/acetonitrile（2∶8）.The extract is purified by C18solid-phase extraction column and separated by HPLC.Sudan dyes are detected by fluorescence detection after on-line photochemical derivatization，and quantified by external standard method.The results show that the calibration curves for four kinds of Sudan dyes are linear in the range of 0.10～1.05μg/mL，with correlation coefficient（R2）more than 0.999.The recoveries of the standards spiked in real chili products samples for four kinds of Sudan dyes are above 85%，the relative standard deviation RSD（%）is 1.58%～4.36%.The limits of detection（LODs）are in the range of 0.30～0.45μg/kg and the limits of quantification（LOQs）are 1.00～1.50μg/kg.The developed method is simple，sensitive，with good repeatability and can be applied for the routine analysis of Sudan dyes in food.

solid-phase extraction；photochemical derivatization；HPLC；fluorescence detection；Sudan dyes

TS201.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.032

1000-9973（2017）03-0133-05

2016－09－14

王韦岗（1984－），男，工程师，硕士，主要从事食品检测工作。