白及萃取物的抑菌活性及其二氯甲烷萃取物化学成分分析

吴永祥 - 程满怀 - 江海涛 - 侯书增 - 万志兵 -

(1. 黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041；2. 黄山学院分析测试中心，安徽 黄山 245041)

白及 [Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.] 又名白根、紫兰、地螺丝等，为兰科植物白及的干燥块茎。白及广泛分布于中国长江流域，主产于安徽、浙江、江苏、云南、四川等地，有很高的药用价值，具有补肺、收敛止血、消肿、生肌等功效，可用于治疗肺伤咳血、疮疡肿毒、外科创伤、胃及消化道溃疡疼痛等症状[1-2]。现代药理研究表明：白及的主要化学成分是联苄类[3]、菲类及其衍生物[3]、多酚类[4]、黄酮类[5]、多糖[6]等，具有抗肿瘤[7]、抗病毒[8]、抗氧化[9]、抗炎症[5]、抑制酪氨酸酶[10]及促进创伤愈合[11]等作用。国内外学者对白及的研究主要集中在多糖及其抗氧化方面[6-7,9]，对白及不同极性萃取物抑菌活性的研究仍然缺乏，关于白及活性成分分离与化学成分分析的研究尚未见报道。

随着对羟基苯甲酸丙酯 (Propylparaben, PP)、苯甲酸、苯甲酸钠盐等食品防腐剂在食品工业的广泛应用，虽然在抑制微生物生长，防止食品品质劣变等方面有显著效果，但是这些人工合成的防腐剂对人体存在着潜在的危害，甚至引发癌症[12-13]。研究开发安全、高效、天然抑菌剂的形势日趋紧迫。本研究以白及为原料，采用甲醇回流提取，并依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水对其进行萃取，得到5种不同极性萃取物，探讨各萃取物的抑菌效果，采用GC-MS研究抑菌活性最显著萃取物的化学成分，挖掘白及作为新的抗菌药物的开发潜力，旨在为其在食品和药品方面的研究与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

白及：2016年10月于安徽省黄山市祁门县采集；

大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)：武汉大学微生物保藏中心；

蛋白胨、牛肉膏、琼脂等生物试剂：北京陆桥技术有限责任公司；

二甲基亚砜、甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等：分析纯，南京化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

气相色谱—质谱联用仪：Agilent HP7890-5975C型，美国Agilent公司；

全波长酶标仪：SpectraMax-190型，美国Molecular Devices公司；

旋转蒸发仪：EV341型，北京莱伯泰科仪器有限公司；

超纯水仪：Sartorius arium comfort II型，德国赛多利斯集团；

超净工作台：DL-CJ-1N型，北京东联哈尔仪器制造有限公司；

不锈钢立式电热蒸汽消毒器：YM50Z型，上海三申医疗器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白及各萃取物的制备 将新鲜白及洗净晾干，于60 ℃ 烘干至恒重，粉碎过80目筛，得白及粉末。称取白及粉末，按照料液比1∶10 (g/mL)加入甲醇，60 ℃恒温回流提取3 h，重复3次，抽滤后经旋转蒸发浓缩，得到白及甲醇提取物。将甲醇提取物以1∶10 (g/mL)混悬于蒸馏水中，依次用等体积正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，经旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥得到正己烷萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层剩余物。准确称取上述样品，用二甲基亚砜溶解，4 ℃保存备用。

1.2.2 菌种活化与菌悬液制备 将受试菌接种到新鲜斜面培养基上进行活化，37 ℃恒温培养24 h。取活化好的菌种用生理盐水配置成浓度为106～107CFU/mL的菌悬液[14-15]，振荡摇匀，4 ℃保存待用。

1.2.3 滤纸片法测定各萃取物的抑菌作用 在超净工作台中，将灭菌好的培养基倒入培养皿，冷却凝固后，吸取制备好的菌悬液100 μL于培养皿上，均匀涂布。用移液枪于无菌直径6 mm的滤纸片中央加入10 μL浓度为10 mg/mL的白及各萃取物，以二甲基亚砜为空白对照组 (control)，以对羟基苯甲酸丙酯为阳性对照组 (positive control, PP)。将处理好的培养皿倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，培养后用游标卡尺采用十字交叉法测定抑菌圈直径(mm)，结果重复3次，取平均值。

1.2.4 最小抑菌浓度测定 将白及的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物分别配制成2，5，10，15，20 mg/mL不同浓度的样品溶液，然后参照文献[16～17]的方法，观察各平板抑菌圈的有无，首次出现抑菌圈所对应的二氯甲烷萃取物的浓度即为MIC。

1.2.5 GC-MS化学成分分析 色谱条件：色谱柱为HP-5 MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm) 的弹性石英毛细管柱；色谱柱初始温度60 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；载气为高纯氦气 (99.999%)，载气流速1.0 mL/min；无分流进样，进样量0.5 μL。 质谱条件：离子源为EI，离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围35～450 amu；采用NIST08标准谱库进行检索。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，利用Duncan’s多重比较法分析样本间的差异显著性，P<0.05认为样本间具有显著性差异。所有试验重复3次，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 白及不同极性萃取物的抑菌效果

由表1可知，除乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物无明显抑制作用外，白及的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌均有较强的抑制作用，以二氯甲烷萃取物的抑菌活性最显著(P<0.05)。当二氯甲烷萃取物浓度为10 mg/mL时，对受试菌的抑菌圈直径分别为大肠杆菌 (13.00±0.71) mm，金黄色葡萄球菌 (10.13±0.48) mm，枯草芽孢杆菌 (12.75±0.50) mm，绿脓杆菌 (12.88±0.25) mm。 阳性对照组PP 在浓度为1 mg/mL条件下，对受试菌的抑菌圈直径分别为大肠杆菌 (11.50±0.82) mm，金黄色葡萄球菌 (11.13±0.48) mm，枯草芽孢杆菌 (12.38±0.25) mm，绿脓杆菌 (12.00±0.71) mm。由此可知，二氯甲烷萃取物和阳性对照PP对4种受试菌均具有显著的抑制作用，其中白及二氯甲烷萃取物对革兰氏阴性细菌的抑制效果优于革兰氏阳性细菌。

表1 白及不同极性萃取物对4种菌的抑菌圈直径†

† 萃取物浓度为10 mg/mL；同列不同上标字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05)。

2.2 白及活性萃取物的最小抑菌浓度

为了定量研究白及活性萃取物对食品中常用菌的抑制效果，本试验进一步测定了其最小抑菌浓度(MIC)，其中不同浓度的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物对4种受试菌的抑制效果见图1。由图1可知，白及活性萃取物对4种受试菌的抑菌圈直径与浓度呈显著正相关，在2～20 mg/mL 时，二氯甲烷萃取物对绿脓杆菌的抑菌圈直径分别为 (10.88±0.48)，(12.13±1.31)，(12.88±0.25)，(13.75±0.65)，(14.00±0.41) mm。白及甲醇提取物对大肠杆菌、绿脓杆菌的MIC为2 mg/mL，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的MIC为5 mg/mL；正己烷萃取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的MIC为2 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC为5 mg/mL；二氯甲烷萃取物对4种受试菌的MIC均为2 mg/mL。表明白及活性萃取物抑菌作用排序为二氯甲烷萃取物>正己烷萃取物>甲醇提取物。

2.3 白及二氯甲烷萃取物化学成分的GC-MS分析

采用GC-MS对白及不同极性萃取物中抑菌作用最显著的二氯甲烷萃取物进行化学成分分析，得到二氯甲烷萃取物化学成分的总离子流图，结果见图2。各组分峰用NIST08质谱库进行检索，从二氯甲烷萃取物中共鉴定出11种化合物，占总峰面积量的94.16%。鉴定匹配度高于80%的化学成分，按峰面积归一化法计算出各化学成分的相对含量，结果见表2。二氯甲烷萃取物含有芳香族、酯、酮、有机酸、醇类等多种成分，以芳香族、酯、酮、有机酸类为主，其中含有4种芳香族化合物(42.85%)、3种酯类化合物(35.11%)、2种酮类化合物(11.70%)、1种有机酸(3.86%)。二氯甲烷萃取物中含量较高成分有2-甲基-3,4-苯并菲(39.97%)、高香兰酸乙酯(25.25%)、反式-4′-氟-4-甲硫基查耳酮(9.44%)、癸二酸二异辛酯(7.34%) 和亚油酸(3.86%) 等。

3 结论

经过以上试验可知，除乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物无明显抑制作用外，白及的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌和绿脓杆菌均具有较强的抑制作用，且随着萃取物浓度的增加，其抑菌作用不断增强。二氯甲烷萃取物的抑菌活性最显著，其对4种受试菌的最小抑制浓度均为2 mg/mL。GC-MS分析结果显示，二氯甲烷萃取物的主要化学成分以芳香族、酯、酮、有机酸类化合物为主，其中含量较高成分有2-甲基-3,4-苯并菲(39.97%)、高香兰酸乙酯(25.25%)、反式-4′-氟-4-甲硫基查耳酮(9.44%)、癸二酸二异辛酯(7.34%) 和亚油酸(3.86%) 等。研究[18-19]发现高香兰酸乙酯、亚油酸等化合物能够有效地抑制微生物的生长。二氯甲烷萃取物中高含量的芳香族、酯、有机酸类化合物可能是其抑菌活性的物质基础[20-21]，但未知的是哪种或哪几种成分发挥主要作用，需进一步分离纯化，以筛选出更加明确有效的抑菌活性成分。本研究表明白及二氯甲烷萃取物有一定的药学研究价值和作为天然食品防腐抑菌剂的潜能。

图1 白及活性萃取物对4种菌的抑菌圈直径

Figure 1 Diameter of inhibitory zone of active fractions ofB.striataagainst four common bacterial strains

图2 白及二氯甲烷萃取物的GC-MS总离子流图Figure 2 Total ion chromatogram of dichloromethane fraction of B.striata表2 白及二氯甲烷萃取物的化学成分及其相对含量

Table 2 Chemical constituents and relative contents of dichloromethane fraction ofB.striata

序号保留时间/min化合物相对含量/%130．62832，4⁃二叔丁基苯酚0．27235．1579β⁃桉叶醇0．64346．8272亚油酸3．86449．80554⁃甲氧基苯基磷酸二乙酯2．52550．8899高香兰酸乙酯25．25651．50734⁃乙基⁃2⁃甲氧基苯酚1．75753．39082⁃甲基⁃3，4⁃苯并菲39．97854．09133⁃甲基⁃3，4⁃苯并菲0．86954．3715反式⁃4′⁃氟⁃4⁃甲硫基查耳酮9．441055．8865癸二酸二异辛酯7．341156．34835，6，7，8⁃四氢⁃2⁃甲氧基⁃5，5⁃二甲基蒽⁃1，4⁃二酮2．26

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