ROCKI/II在转化生长因子β1诱导的主动脉平滑肌细胞表型转化中的作用

汪海波，高旭辉，朱健，郗二平，张瑜，王正，刘子豪，谢彪，朱水波

（中国人民解放军广州军区武汉总医院 心胸外科，湖北 武汉 430070）

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的表型转化与主动脉夹层（aortic dissection，AD）的发生发展密切相关[1]。VSMC的表型转化与VSMC增殖迁移密切相关，当VSMC发生由收缩型向合成型的转化后细胞的增殖迁移能力也相应增加。有研究[2]显示，转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）可呈浓度依赖性诱导人主动脉VSMC增殖迁移，发生由收缩型向合成型的表型转化。前期实验研究[3]结果显示，TGF-β1可诱导人主动脉VSMC（HA-VSMC）发生增殖与迁移，且ROCKI基因对TGF-β1诱导的HA-VSMCs迁移可能有抑制作用，而ROCKI和ROCKII基因对TGF-β1诱导的HA-VSMCs增殖均无明显影响。本实验进一步观察ROCKI和ROCKII基因下调对TGF-β1诱导HA-VSMC收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白（smooth muscle α-actin，α-SMA）、平滑肌22α（smooth muscle 22α，SM22α）以及合成型标志物骨桥蛋白（osteopontin，OPN）表达的影响，从而探讨ROCKI和ROCKII基因在TGF-β1诱导HA-VSMC转化中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞：HA-VSMC（美国ATCC公司）。主要试剂：TGF-β1（美国Peprotech公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；胰酶-EDTA（吉诺生物医药技术有限公司）；DMEM高糖培养基（HyClone）；PBS（吉诺生物医药技术有限公司）；青霉素-链霉素溶液（100×）（吉诺生物医药技术有限公司）；TRIzol Reagent（Invitrogen™）；三氯甲烷、异丙醇以及无水乙醇（国药集团化学试剂）；PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR® Premix Ex Taq™（TaKaRa）；siRNA（广州锐博）；Y-27632（美国Selleck）；Opti-MEM I Reduced serum medium（美国Gibco）；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（美国Invitrogen）；GAPDH（ab37168）、α-SMA（ab124964）、SM22α（ab14106）以及O P N（ab91655）（abcam公司）；HRP-Goat anti Rabbit（074-1506）（KPL）；GNM14170型D-Hanks（吉诺生物医药技术有限公司）。主要仪器：SCO6WE型CO2恒温培养箱（SHEL LAB）；SW-CJ-1FD型洁净工作台（苏净安泰）；IX51型倒置显微镜（OLYMPUS）；TGL-16c型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TGL-16型冷冻离心机（湖南湘仪仪器）；IMS-20型制冰机（常熟市雪科电器有限公司）；基因扩增仪TC-XP型PCR仪（杭州博日科技）；StepOne™ Real-Time PCR System型荧光定量PCR仪（Life technologies）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 在37 ℃、5%CO2条件下用含10%FBS的高糖DMEM培养基培养 HA-VSMCs。培养基按照1:100加入青链霉素混合液（含1000 U/mL青霉素和10 mg/mL链霉素）。HA-VSMC培养达85%～90%融合率时用胰酶消化细胞，用细胞计数板计数，稀释至所需浓度，按照需要进行细胞干预及后续实验。

1.2.2 siRNA转染 ⑴ 转染前1 d，胰酶消化收集细胞，加入不含抗生素的培养基，调整细胞密度为2×105/mL，以每孔2 mL接种至6孔板。转染时要求细胞汇合度为50%～60%。⑵ 转染液制备（siRNA储存液浓度为20 µM），每孔用量如下：用 190 µL Opti-MEI无血清培养基将 10 µL siRNA稀释，轻轻混匀。使用前轻轻摇匀Lipofectamine 2000，取 20 µL Lipofectamine 2000 在 18 µL 无血清培养基中稀释，室温孵育5 min。将前2步缩稀释的siRNA和Lipofectamine 2000混合（总体积400 µL），轻轻混匀，室温静置20 min。⑶ 将孔板内的培养基更换为不含FBS的DMEM培养基，转染孔加1.6 mL，空白孔加2 mL。⑷ 在需要转染的孔中加入400 µL转染液，轻轻摇匀。⑸ 37 ℃培养，转染4～6 h后，细胞换液为含FBS的DMEM培养基，24 h后倒置显微镜下观察转染效果（绿色荧光），记录图片；转染48 h后，用Western blot两种转染后的细胞、两种转染后的细胞加TGF-β1（5 ng/mL）处理以及HA-VSMC单纯TGF-β1（5 ng/mL）处理后ROCKI和ROCKII蛋白的表达。

1.2.3 ROCKI和ROCKII对TGF-β1诱 导的HA-VSMC表型转化 将细胞分成5组：⑴ 空白对照组（正常细胞在完全培养基中培养24 h）；⑵ TGF-β1组（正常细胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基中培养24 h）；⑶ ROCKI siRNA+TGF-β1组（转染ROCKI siRNA的 细胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基中培养24 h）； ⑷ ROCKII siRNA+TGF-β1组（ 转 染ROCKII siRNA的细胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基中培养24 h）；⑸ Y-27632+TGF-β1组（正常细胞用10 µmol/mL ROCK非特异性抑制剂Y-27632预处理1 h，之后换培养液，在含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基中培养24 h）。提取上述5组细胞内总蛋白进行Western blot和荧光定量PCR检测α-SMA、SM22α、OPN蛋白表达水平及mRNA表达表达水平。各实验重复3次。胶片扫描为TIF格式图片，AlphaEaseFC软件分析目标带的光密度值。

1.3 统计学处理

结果用SPSS软件做方差分析，不同组之间应用分析方法为ANOVA单因素方差分析，数据以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ROCKI和ROCKII的siRNA转染结果以及转染后ROCKI和ROCKII蛋白的表达

HA-VSMC转染ROCKI和ROCKII的siRNA 24 h后，使用倒置显微镜观察转染结果，镜下可见大量转染成功的HA-VSMC（图1）。Western bolt检测结果显示，HA-VSMC转染ROCKI和ROCKII的siRNA 48 h后，细胞ROCKI和ROCKII蛋白表水平达较空白对照组明显降低（均P＜0.05），TGF-β1处理能明显升高HA-VSMC中ROCKI蛋白表水平（P＜0.05），但对ROCKII蛋白表水平明无明显影响（P＞0.05），ROCKI siRNA转染+TGF-β1处理的细胞中ROCKI蛋白表水平也较单独TGF-β1处理的细胞明显降低（P＜0.05）（图2）。

图1 荧光显微镜检测转染结果（×100） A：ROCKI siRNA转染；B：ROCKII siRNA转染Figure 1 Transfection results observed by fluorescence microscope (×100) A: ROCKI siRNA transfection; B: ROCKII siRNA transfection

图2 Western bolt检测转染后ROCKI/II蛋白表达 1：空白对照组；2：ROCKI siRNA转染组；3：ROCKII siRNA转染组；4：TGF-β1组；5：ROCKI siRNA转染+TGF-β1组；6：ROCKII siRNA转染+TGF-β1组Figure 2 Western bolt detection for ROCKI/II protein expressions after transfection 1: Blank control group; 2: ROCKI siRNA transfection group; 3: ROCKII siRNA transfection group; 4: TGF-β1 treatment group; 5: ROCKI siRNA transfection+TGF-β1 treatment group; 6: ROCKII siRNA transfection+TGF-β1 treatment group

2.2 ROCKI和ROCKII对TGF-β1诱导的HAVSMC表型标志物蛋白表达的影响

与空白对照组比较，TGF-β1组收缩型VSMC的标志物α-SMA、SM22α蛋白表达量明显减少，而合成型VSMC的标志物OPN蛋白表达量明显增加（均P＜0.05）。与TGF-β1组比较，ROCKI siRNA+TGF-β1组与Y-27632+TGF-β1组收缩型VSMC的标志物α-SMA、SM22α蛋白表达明显增加，而合成型VSMC的标志物OPN蛋白表达量减少（均P＜0.05）；与TGF-β1组比较，ROCKIIsiRNA+TGF-β1组的收缩型VSMC的标志物α-SMA、SM22α和合成型VSMC的标志物OPN的蛋白表达量均无明显差异（均P＞0.05）（图3）。

2.3 ROCKI和ROCKII对TGF-β1诱导的HAVSMC表型标志物mRNA表达的影响

与空白对照组比较，TGF-β1组的收缩型VSMC的标志物α-SMA、SM22α的mRNA含量明显减少，而合成型VSMC的标志物OPN的mRNA含量明显增加（均P＜0.05）。与TGF-β1组比较，ROCKI siRNA+TGF-β1组与Y-27632+TGF-β1组收缩型VSMC的标志物α-SMA、SM22α的mRNA含量明显增加，而合成型VSMC的标志物OPN的mRNA含量明显减少（均P＜0.05）；与TGF-β1组相比，ROCKII siRNA+TGF-β1组的收缩型VSMC的标志物α-SMA、SM22α和合成型VSMC的标志物OPN的mRNA含量均无明显差异（均P＞0.05）（图4）。

图3 Western bolt检测各组α-SMA、SM22α及OPN蛋白表达量 1：空白对照组；2：TGF-β1组；3：ROCKI siRNA转染+TGF-β1组；4：ROCKII siRNA转染+TGF-β1组；5：Y-27632+TGF-β1组Figure 3 Western bolt analysis for protein expressions of α-SMA, SM22α and OPN in each group 1: Blank control group; 2: TGF-β1 treatment group; 3: ROCKI siRNA transfection+TGF-β1 treatment group; 4: ROCK II siRNA transfection+TGF-β1 treatment group;5: Y-27632+TGF-β1 treatment group

图4 RT-PCR检测各组α-SMA、SM22α及OPN mRNA含量 1：空白对照组；2：TGF-β1组；3：ROCKI siRNA转染+TGF-β1组；4：ROCKII siRNA转染+TGF-β1组；5：Y-27632+TGF-β1组Figure 4 RT-PCR detection of mRNA expressions of α-SMA, SM22α and OPN in each group 1: Blank control group; 2: TGF-β1 treatment group; 3: ROCKI siRNA transfection+TGF-β1 treatment group; 4: ROCK II siRNA transfection+TGF-β1 treatment group;5: Y-27632+TGF-β1 treatment group

3 讨 论

AD是急诊中常见的危急重症，进展快且病死率高，多发生于青壮年男性[4]。近年来，随着生活水平的提高及社会压力的增加，国内AD的发生率呈逐年增加的趋势。有关AD的研究显示，AD的最初病变位于主动脉中膜层的平滑肌细胞[5-6]。相较于正常人，AD患者的VSMC增殖、迁移能力均增强，收缩型VSMC的标志物α-SMA、SM22α表达减少，而合成型VSMC的标志物OPN表达增加[7-9]。有研究[10]表明，在AD患者主动脉中膜层中TGF-β1的含量明显较正常人主动脉组织中高。在TGF-β1的作用下HA-VSMC可发生由收缩型向合成型的表型转化并且其增殖、迁移能力明显增强[2,11]。

ROCK是Rho下游的效应器之一。ROCK的分子结构包括氨基酸端的催化结构域，中间的Rho结合α卷曲螺旋结构域和羧基端PH结构域。当激活状态的Rho与ROCK的激酶结合结构域相互作用时，ROCK可发生多个氨基酸位点的磷酸化而被激活，从而引导其下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应。ROCK蛋白在Rho/Rock信号通路中扮演重要作用，而该信号通路参与细胞的多种生物学行为，可调节细胞分裂、收缩、迁移、黏附、分泌等重要生命活动，是近年来研究比较热门的一条重要信号转导通路。ROCK包括ROCKI和ROCKII两种异构体，两者激酶区的同源性可达90%[12]。有研究[13]通过siRNA转染下调ROCKI和ROCKII基因表达证实，ROCKI在大鼠平滑肌细胞的迁移中起主导作用，而ROCKII的作用不明显；在大鼠平滑肌细胞的增殖中，两者的作用均不明显。此外，TGF-β1可通过Rho/ROCK信号通路刺激大鼠颈内平滑肌细胞（ISMC）表型转化[14]。因此，ROCKI/II在TGF-β1刺激的HA-VSMC表型转化中可能起到一定的作用。

本实验采用体外培养HA-VSMC，通过转染技术下调HA-VSMC的ROCKI和ROCKII基因表达，利用外源性TGF-β1刺激细胞。根据前期试验结果[2]，本实验选择浓度为5 ng/mL的TGF-β1，作用时间为2 4 h。将细胞分为空白对照组、TGF-β1组，ROCKI siRNA+TGF-β1组，ROCKII siRNA+TGF-β1组和Y-27632+TGF-β1组进行Western bolt和RT-PCR检测。其中，Y-27632为ROCK非特异性抑制剂。选取收缩型VSMC标志物α-SMA、SM22α和合成型VSMC标志物OPN，采用Western bolt和RT-PCR技术检测相关VSMC表型转化的标志物。与空白对照组相比，TGF-β1组的α-SMA、SM22α蛋白表达量和mRNA表达量减少而OPN蛋白表达量和mRNA表达量均增加，进一步证实TGF-β1可诱导HA-VSMCs发生由收缩型向合成型转化。与TGF-β1组相比，ROCKI siRNA+TGF-β1组α-SMA、SM22α蛋白表达量和mRNA表达量增加而OPN蛋白表达量和mRNA表达量减少；ROCKII siRNA+TGF-β1组α-SMA、SM22α和OPN蛋白表达量和mRNA表达量均无显著差异。可见ROCKI基因下调可抑制TGF-β1诱导HA-VSMCs由收缩型向合成型转化的作用，而ROCKII基因下调后对TGF-β1诱导HAVSMC由收缩型向合成型转化的作用无明显影响。

综上，在TGF-β1诱导下的HA-VSMC表型转化中ROCKI起主要作用，而可能与ROCKII无关。此外，后续研究将通过稳转细胞系及过表达等技术进一步探究ROCKI和ROCKII对TGF-β1诱导HA-VSMC表型转化的影响，从而为进一步探讨HA-VSMC结构功能改变的分子机制及其与AD发病的关系提供了更多实验依据，为抑制HA-VSMCs表型转化提供潜在的治疗靶点，并为临床治疗AD提供一定的研究基础。

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