橡胶草染色体制片技术研究

2017-03-23杨玉双甘霖覃碧刘实忠

热带农业科学 2017年2期

关键词：嫩叶

杨玉双++甘霖++覃碧++刘实忠

摘要以橡胶草根尖和嫩叶为材料，对其染色体制片技术的取样时间、预处理试剂、解离方法及解离时间进行比较研究。结果表明：橡胶草根尖和嫩叶取样最佳时间均为上午8：00～10：00；2 mmol/L 8-羟基喹啉溶液室温预处理4 h效果最好；根尖和嫩叶用1 mol/L盐酸于60℃下分别酸解10和12 min效果良好。

关键词橡胶草；根尖；嫩叶；染色体制片技术

中图分类号 S576 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.008

Development of Technique for Chromosome Squashing

of Taraxacum kok-saghyz Rodin

Yang Yushuang1） Gan Lin1） Qin Bi1） Liu Shizhong2）

（1 Rubber Research Institute，CATAS，Danzhou，Hainan 571737 China；

2 Guangzhou Experimental Station，CATAS，Guangzhou，Guangdong 510140 China）

Abstract The root tips and young leaves of Taraxacum kok-saghyz Rodin were used for chromosome squashing to compare the differences in chromosome squashing through sampling time， pretreatment chemical solution， hydrolysing methods and time of chromosome squashing. The results showed that the root tips and young leaves were best sampled at about 8：00～10：00 am， pretreated in 2 mmol/L 8-hydroxyquinoline solution at a room temperature for 4 hours and hydrolysed with 1 mol/L HCl at 60℃ for 10 and 12 min respectively for chromosome squashing.

Keywords Taraxacum kok-saghyz Rodin ； Root tip； Young leaf ； Chromosome squashing technique

橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）为菊科蒲公英属大角蒲公英组多年生草本植物。原产于哈萨克斯坦、欧洲以及中国新疆等地，其染色体数目为2n=2x=16[1-2]。因其根部橡胶含量高、品质优良、适应性强等诸多优点，成为具有发展前途的巴西橡胶树橡胶替代作物之一[3-5]。简捷稳定的染色体制片技术对于遗传育种和种质资源分析具有重要意义[6]。至今尚未见橡胶草染色体制片相关研究报道。压片法因操作步骤较少、操作简便、容易掌握等特点，在植物染色体制片中被广泛使用[7-10]。大量研究显示，制片材料的选取时间、预处理、解离等步骤对制片成功率及制片效果至关重要，不同植物及取材部位的最优处理条件也往往存在差异[11-15]。本研究以橡胶草根尖和嫩叶为材料，对其取样时间，预处理试剂和处理时间、解离方法及解离时间进行了比较研究，以期筛选出一套高效、稳定的染色体制片技术，为橡胶草倍性育种、种间杂交及种质资源分析等研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）的幼根和嫩叶。

幼根：种子用灭菌灵浸泡24 h后，分散置于培养皿中室温培养（25℃），待根长至1～2 cm左右，取根尖0.5～1 cm。

嫩叶：生长旺盛植株未展开的嫩叶（长约1.5～2 cm）。

1.2 方法

1.2.1 取样时间

橡胶草根尖和嫩叶分别于8：00、10：00、12：00和14：00，4个不同时间取样，比较不同取样时间获得的中期分裂相细胞情况，筛选最适取样时间。

1.2.2 预处理

选用2种预处理试剂：（1）1%秋水仙素（Biodee公司）室溫处理，处理时间分别为2、3和4 h；（2）2 mmol/L 8-羟基喹啉（Sigma）室温处理，处理时间分别为2、3和4 h。之后，转入卡诺氏固定液（V酒精∶V乙酸=3∶1）于 4℃冰箱固定24 h。

1.2.3 解离

选用2种解离方法，（1）酸解法：固定好的材料用ddH2O清洗2次，每次10 min，然后放入1 mol/ L盐酸中于60 ℃恒温下分别处理8、10、12和16 min；（2）酶解法（参照陆坤等[16]的方法并稍作改动）：固定好的材料用ddH2O浸洗2次，每次10 min，加A+B 缓冲液（终浓度：4 mmol/L 柠檬酸、6 mmol/L 柠檬酸钠）浸洗2次，每次10 min。然后，转入2.5%果胶酶（Solarbio）和2.5%纤维素酶（Sigma）混合溶液于37℃下酶解，处理时间分别为30、40、50、60 min。之后，用ddH2O清洗3次，每次5 min。

1.2.4 染色、制片和镜检

采用改良苯酚品红染液（Solarbio）染色，常规压片法制片。用Leica DMLB显微镜镜检，Leica DFC500摄像头拍照。

2 结果与分析

2.1 取样时间分析

对橡胶草根尖和嫩叶的取样时间进行比较分析（表1）。结果表明，无论是橡胶草根尖还是嫩叶，其最佳取样时间均为上午8：00～10：00。在此时间段取到的样品的中期分裂相细胞所占比例较多，容易找到分散较好的染色体分裂相，而其它时间获得的中期分裂相相对较少。

2.2 预处理试剂和处理时间对制片效果的影响

对2种预处理试剂及处理时间的制片效果进行比较分析（表2）。结果表明，用2 mmol/L 8-羟基喹啉处理的染色体浓缩程度适宜，形态清晰，效果最好（图1-C和1-D）；0.1%秋水仙素处理的染色体浓缩程度适宜，形态较清晰，但是染色背景颜色较深，效果次之（图1-A和1-B）。不同预处理时间的比较结果显示，2 mmol/L 8-羟基喹啉和0.1 %秋水仙素处理4 h的染色体浓缩程度和清晰度均好于2和3 h处理的效果。综上分析，用2 mmol/L 8-羟基喹啉处理4 h的制片效果最好。

2.3 解离方法和解离时间对解离效果的影响

对2种解离方法及解离时间的制片效果进行比较分析，结果（表3）显示，橡胶草根尖酸解10 min和酶解40 min时，细胞壁解离充分，压片后细胞分散程度好，染色体分辨清晰，制片效果最好。叶片的最佳酸解和酶解时间分别为12 和50 min。解离时间不足时，细胞存在重叠现象，难以压散，染色体重叠严重，分辨不清，无法计数（图1-E和1-F）。解离时间过长，则会导致细胞破碎，染色体缺失或混杂，染色变浅，影响观测效果（1-G和1-H）。

3 讨论与结论

3.1 取样部位与时间

根尖的分生组织有丝分裂旺盛，细胞壁薄，且取材容易，操作简便，因此，植物细胞染色体标本的制备多以根尖为材料。但是，对于大田生长植物的倍性鉴定等工作，利用幼嫩叶片为材料进行染色体制片显得更加方便快捷。张健[12]和高和琼等[17]分别对橡胶树和木薯叶片的染色体制片技术进行了摸索和优化，取得了不错的效果。本研究分别对橡胶草的根尖和嫩叶组织的染色体制片技术进行摸索，结果显示，虽然嫩叶的细胞中期分裂相要少于根尖的细胞中期分裂相，但是对制片效果并没有太大影响，均能有效用于细胞染色体观察试验。制片要获得较多的分裂相，需保证取样时组织细胞处于旺盛的分裂期，取材时间非常重要。本研究结果显示，无论是橡胶草根尖还是嫩叶，其最佳取样时间均为上午8：00～10：00，此时间段取到样品的中期分裂相细胞所占比例较多，容易找到分散较好的分裂相。这与许多蒲公英属植物的最佳取材时间基本一致[18-20]，说明橡胶草在这一时间段处于生长旺盛期。

3.2 预处理

预处理的主要目的就是通过阻断、抑制和破坏纺锤丝的形成使细胞分裂停滞在中期，进而获得更多的中期分裂相细胞，以便于压片和观察。因此，预处理是染色体制片中的关键环节。本研究比较了2种预处理试剂的制片效果。2 mmol/L 8-羟基喹啉处理的染色体浓缩程度适宜，形态清晰，效果很好。张健[18]和钟淑梅[20]在普通蒲公英染色体制片中用8-羟基喹啉预处理也获得了不错的效果；0.1%秋水仙素处理的染色体浓缩程度适宜，形态较清晰，但是染色背景颜色较深，效果次之。预处理时间对制片效果也非常重要，处理时间过短和过长都会影响制片效果。本研究结果显示，2 mmol/L 8-羟基喹啉和0.1%秋水仙素处理4 h的染色体浓缩程度和形态清晰度最佳。2 和3 h预处理时间不足，导致染色体浓缩程度不到位，染色体形态模糊、拖尾，很难进行核型分析等后续研究。

3.3 解离

解离目的是使细胞分离，软化细胞壁和降解部分细胞质，便于染色体分散和展平，便于染色体观察，在染色体制片过程中非常关键。本研究表明，橡胶草根尖酸解10和酶解40 min时，细胞壁解离充分，压片后细胞分散程度好，染色体分辨清晰，制片效果最好。嫩叶的最佳酸解和酶解时间分别为12 和50 min。无论是根尖还是嫩叶，解离时间不足时，细胞壁解离不充分，细胞存在重叠现象，难以压散，染色体重叠严重，分辨不清，无法计数。解离时间过长，会导致细胞破碎，染色体缺失或混杂，而且染色体着色困难，影响观测效果，这在大量植物的染色体制片研究中已得到证实[11-14，17]。本研究对酸解法和酶解法在橡胶草中的使用效果进行了比较分析：（1）酸解法的解离时间更短。橡胶草根尖和嫩叶的酸解解离时间均明显短于其酶解解离时间；（2）酸解法操作更加简便稳定，容易掌握。虽然酶解法解离更加充分，细胞分散更好，但其操作过程相对繁琐，且酶解后的材料松软、易碎，分生组织容易丢失，从而导致制片效率较低；（3）在染色体的分散程度、形态清晰度方面，酸解法与酶解法之间没有明显差别。综上所述，对于橡胶草根尖和嫩叶的染色体制片技术，采用酸解法会更加简便快捷、操作稳定、易于掌握。

染色體制片效果受多种因素影响。其中，采样时间、预处理和解离是影响制片效果的关键步骤。本研究以橡胶草根尖和嫩叶为材料，对取样时间、预处理和解离进行了比较研究，结果表明，橡胶草根尖和嫩叶的最佳取样时间均为上午8：00～10：00；2 mmol/L 8-羟基喹啉处理4 h的染色体浓缩程度适宜，形态清晰，效果最好；对于橡胶草根尖和嫩叶的染色体制片技术，采用酸解法会更加简捷、稳定和易于掌握。橡胶草根尖最佳酸解时间为10 min，嫩叶的最佳酸解时间为12 min。

参考文献

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