嘉宝果嫩叶提取物不同极性部位抗氧化及抑制α葡萄糖苷酶活性研究

邱珊莲 林宝妹 张少平 张树河 张帅 洪佳敏 郑开斌

摘  要  从植物中寻找天然的抗氧化剂和α葡萄糖苷酶抑制剂对糖尿病患者具有重要的意义。采用比色法对嘉宝果嫩叶醇提物不同极性部位进行总多酚和总黄酮含量、抗氧化活性及α葡萄糖苷酶活性抑制活性研究，以期为嘉宝果嫩叶有效提取部位在食品、化工及医学领域的应用提供一定的参考依据。结果表明，乙酸乙酯相的总多酚含量（33.92 mg/g及总黄酮含量（13.35 mg/g）最高，其次为正丁醇相（总多酚31.11 mg/g;总黄酮12.93 mg/g）及水相（总多酚17.04 mg/g;总黄酮11.18 mg/g）;石油醚相及二氯甲烷相均未检测到总多酚及总黄酮。乙酸乙酯相与正丁醇相对DPPH及ABTS+自由基的清除能力相当，明显高于其他极性部位。对酵母源和小鼠小肠源α葡萄糖苷酶活性抑制活性大小依次分别为乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>石油醚相>二氯甲烷相和乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>二氯甲烷相>石油醚相。以上结果表明嘉宝果嫩叶乙酸乙酯相与正丁醇相总多酚及总黄酮含量较高，抗氧化活性及对α葡萄糖苷酶活性的抑制作用较强，是挖掘抗氧化及抑制α葡萄糖苷酶活性物质的主要极性部位。

关键词  嘉宝果;嫩叶;醇提物;不同极性部位;抗氧化;α葡萄糖苷酶

中图分类号  S667.9      文献标识码  A

Abstract  It is of great significance to search for natural antioxidants and α-glucosidase inhibitors from plants to diabetic patients. Based on the previous research， the polarity fractions of the ethanol extracts from the tender leaves of M. cauliflora were applied to determine the scavenging effects towards DPPH and ABTS+ free radicals， inhibition on α-glucosidase activity， the contents of total polyphenols （TP） and total flavonoids （TF） by colorimetry， providing a reference evidence for the application of effective polarity fraction from the tender leaves of M. cauliflora in food， chemical and medical fields. The ethyl acetate fraction exhibited the highest contents of TP （33.92 mg/g） and TF （13.35 mg/g）， followed by n-butanol fraction （TP 31.11 mg/g; TF 12.93 mg/g） and water fraction （TP 17.04 mg/g; TF 11.18 mg/g）. TP and TF were not detected in the petroleum ether and dichloromethane fractions. The scavenging abilities of n-butanol fraction and ethyl acetate fraction towards DPPH and ABTS+ radicals were higher than that of other fractions. The ethyl acetate fraction had the strongest inhibitory activity in the α-glucosidase， followed by the n-butanol and water fraction. This results indicated that the contents of TP and TF were higher in the ethyl acetate and n-butanol fractions， and the antioxidant activity and inhibition in α-glucosidase activity were stronger， compared with the other three polarity fractions， so the ethyl acetate and n-butanol fractions could be used as the main polar fractions to excavate active substances for antioxidation activity and inhibition activity in α-glucosidase.

Keywords  Myrciaria cauliflora; young leaves; ethanol extracts; different polarity fractions; antioxidation; α-glucosidase

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.018

嘉寶果[Myrciaria cauliflora （DC.） Berg]，又名树葡萄、珍宝果、肖柽柳桃金娘、拟爱神木，为桃金娘科拟香桃木属常绿灌木，是南美洲的一种常见果树，中国大陆近年来栽植的嘉宝果均引自中国台湾地区。果实营养成分丰富，富含维生素C、硒、镁等营养元素[1]，果皮富含花青素、没食子酸、槲皮苷、异槲皮苷等功能成分[2-3]，具有良好的抗氧化、抗癌细胞增殖、抗菌、减少胰岛素抵抗等生物活性[4-5]。

α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制小肠黏膜刷状缘α-葡萄糖苷酶对食物中淀粉和糖類的降解，延迟并减少葡萄糖的吸收，从而达到降低餐后血糖效果[6]，是适用于Ⅱ型糖尿病患者、能明显改善餐后血糖的药物，如阿卡波糖和伏格列波糖等。近十几年来的研究表明Ⅱ型糖尿病及其并发症的主要发病机理是氧化应激，氧化应激导致组织损害是体内大量自由基产生及机体抗氧化能力减弱的结果[7-8]。抗氧化剂可减少自由基的产生或直接淬灭体内产生的自由基，并增强机体的抗氧化能力，是预防和治疗糖尿病及其并发症的有效手段[9]。因此，治疗糖尿病及防治并发症，应强调抗氧化应激与控制血糖并重。但是，目前常用的抗氧化剂及α-葡萄糖苷酶抑制剂多为西药，存在较多毒副作用，也不能有效地控制并发症，植物天然产物降糖作用具有多途径、多靶点、多向性的药理特点，不仅可降低血糖，还具有抗氧化及降血脂作用[10-11]，作用温和持久，并能延缓并发症的发生。笔者前期的报道显示嘉宝果植株不同器官中嫩叶具有最高的多酚及黄酮含量及最强的抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性作用[12]，但该报道仅限于粗提物，本研究对嘉宝果嫩叶乙醇提取物进行不同极性溶剂萃取分部，测定各极性部位中多酚及黄酮含量，研究各极性部位抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性，为嘉宝果嫩叶的深度开发利用提供参考。

1  材料和方法

1.1  材料

嘉宝果嫩叶于2018年1月23日采自福建龙海市惠昌嘉宝果专业合作社，供试嘉宝果品种为‘沙巴，随机选取9株树龄为15 a的植株采取嫩叶。嫩叶位于为枝条顶部，呈红色，质地柔嫩且叶脉不清晰。

1.2  方法

1.2.1  嫩叶醇提液的制备  将采集的嘉宝果嫩叶用粉碎机粉碎1 min（28 000 r/min），取4 g粉碎样品与40%乙醇按1∶60料液比混合后进行超声辅助提取10 min，固定超声波破碎仪功率为195 W，连续超声时间3 s，超声间隔时间4 s。提取液离心15 min（6000 r/min），取上清液，减压浓缩至40 mL，得浓缩液（粗提液）。另取一部分嫩叶，称其鲜重后，烘干至恒重，计算干物质百分含量，用于换算干样质量。

1.2.2  极性分部试验  将浓缩液依次用等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次，合并萃取液，正丁醇萃取后的剩余水溶液即水相提取物。将石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相和正丁醇相旋转蒸发浓缩再经真空干燥箱40 ℃干燥至近干，用无水乙醇溶解，定容至40 mL。

1.2.3  小鼠小肠源α-葡萄糖苷酶的分离  取正常小鼠进行解剖，取其小肠，用手术剪剖开，用预冷的0.9%生理盐水充分冲洗干净，滤掉水分，按1∶10的重量比加入0.9%生理盐水进行匀浆5 min，匀浆液于4 ℃、10 000 r/min离心15 min，取上清，于4 ℃过夜，再离心15 min，得到小鼠小肠α葡萄糖苷酶酶液，20 ℃保存备用。

1.2.4  总多酚及总黄酮含量的测定  总多酚及总黄酮含量测定参照林宝妹等[13]的方法。总多酚及总黄酮的含量以嫩叶干重计。

1.2.5  抗氧化活性的测定  DPPH自由基清除能力的测定参照Li等[14]的方法;ABTS+自由基清除能力测定参照Hu等[15]的方法。

1.2.6  α-葡萄糖苷酶活性抑制率测定  酵母源α-葡萄糖苷酶活性抑制率测定参照邱珊莲等[12]的方法。小鼠小肠源α葡萄糖苷酶活性抑制率采用酶标仪测定，取40 μL小鼠α葡萄糖苷酶，加入40 μL样品溶液，37 ℃恒温水浴5 min，然后加入20 μL 15 mmol/L PNPG，摇匀后再于37 ℃恒温水浴15 min后，加入0.2 mol/L碳酸钠溶液100 μL，于入射光波长405 nm处测定吸光度。酶活性抑制率=[1（A1A2）/A0]×100%，式中：A0为溶剂空白对照管吸光值;A2为样品本底值;A1为样品管吸光值。试验中将样品溶液配制成不同浓度梯度溶液，测定各浓度样品液对α葡萄糖苷酶活性的抑制率，绘制抑制率（y）样品浓度（x）曲线，生成回归方程，由曲线读出或用方程计算出半数抑制浓度IC50，单位为嫩叶干质量浓度。

1.3  数据处理

采用Microsoft Excel 2007软件进行线性/对数回归曲线制作;采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析。

2  结果和分析

2.1  总多酚与总黄酮含量

嘉宝果嫩叶提取物不同极性部位的总多酚与总黄酮含量见表1，粗提液中总多酚含量为91.09 mg/g，不同极性部位的多酚含量差异显著（P<0.05），石油醚相及二氯甲烷相未检测到多酚，大部分多酚集中于乙酸乙酯相（33.92 mg/g）和正丁醇相（31.11 mg/g），乙酸乙酯相的多酚含量最高，其次为正丁醇相和水相（17.04 mg/g）。

2.2  抗氧化活性

2.2.1  对DPPH自由基的清除能力  嘉宝果嫩叶提取物不同极性部位对DPPH自由基的清除能力见表2。不同极性部位对DPPH自由基的清除能力差异明显，各极性部位的清除能力均小于粗提液。因石油醚相及二氯甲烷相对DPPH自由基的清除能力弱，未获得线性回归方程并求得IC50，其余3个极性部位在一定的浓度范围内，提取物浓度与DPPH自由基的清除率之间呈现明显的量效关系，R2均大于0.95，以正丁醇相（IC50为 0.9473 g/L）的清除能力最强，乙酸乙酯相（IC50为0.9681 g/L）与其接近，水相清除能力较弱（IC50为2.0365 g/L）。

2.2.2  对ABTS+自由基的清除能力  嘉宝果嫩叶提取物不同极性部位对ABTS+自由基的清除能力见表3。在试验浓度范围内，各极性部位提取物对ABTS+自由基的清除作用随提取物浓度的增加而增强，二者呈线性关系，R2值均大于0.99。不同极性部位对ABTS+自由基的清除能力大小顺序依次为乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>石油醚相>二氯甲烷相，各极性部位的清除能力均小于粗提液，正丁醇相与乙酸乙酯相的清除能力接近。

2.3  对α葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2.3.1  对酵母源α葡萄糖苷酶活性的抑制作用  嘉宝果嫩叶提取物不同极性部位对酵母源α葡萄糖苷酶活性的抑制效果见表4。粗提液对酵母源α葡萄糖苷酶活性的抑制作用最强，高于各极性部位提取物，乙酸乙酯相提取物的抑制活性（IC50 8.3758 mg/L）与粗提液（IC50 7.7288 mg/L）较接近。各极性部位对酵母源α葡萄糖苷酶的抑

2.3.2  对小鼠小肠源α葡萄糖苷酶活性的抑制作用  嘉宝果嫩叶提取物不同极性部位对小鼠小肠源α葡萄糖苷酶活性的抑制效果见图1。在同一质量浓度（10 mg/L）下，粗提物及各极性部位对小鼠小肠源α葡萄糖苷酶的抑制率从大到小依次为乙酸乙酯相（20.69%）>粗提液（15.66%）>正丁醇相（12.87%）>水相（10.51%）>二氯甲烷相（5.00%）>石油醚相（3.96%），与对酵母源α-葡萄糖苷酶的抑制活性相比，差异表现在乙酸乙酯相的抑制活性高于粗提液。

3  讨论

越来越多的研究发现氧化应激与Ⅱ型糖尿病及其大血管或微血管并发症的发生及发展密切相关，目前已发现多种抗氧化剂通过不同的抗氧化机制在Ⅱ型糖尿病及其并发症的防治中具有重要作用[16]。近些年来，从植物中寻找天然抗氧化剂代替人工合成的抗氧化剂已成为一个研究热点。本课题组前期实验表明嘉宝果植株各部位中嫩叶醇提取物对DPPH·、·OH及ABTS+ 3种自由基具有最强的清除作用，且在一定的质量浓度范围内随提取液浓度的增加而增强[12]，但前期该研究仅局限于粗提物，并未对醇提物的有效部位进行研究。本研究通过对嘉宝果嫩叶醇提物不同极性部位抗氧化能力的比较，发现嘉宝果嫩叶不同极性部位对DPPH·和ABTS+2种自由基的清除能力差异较大，其中乙酸乙酯相和正丁醇相的清除能力最强，其次为水相，石油醚及二氯甲烷相较弱。本研究结果与大多植物提取物不同极性部位抗氧化活性研究结果相类似，即各极性部位中乙酸乙酯相和正丁醇相的抗氧化作用明显强于其他极性部位，如山茱萸[17]、女贞子[18]、香椿叶[19]、覆盆子[20]、芒果叶[21]、豆腐柴叶[22]等，存在差异的是除乙酸乙酯及正丁醇相以外的其他部位抗氧化活性大小差异较大，例如豆腐柴叶水相对DPPH·及ABTS+ 2种自由基的清除率高于石油醚相[22]，这与本研究结果相一致，而芒果叶的石油醚相对DPPH·的清除作用却强于水相[21]，这种现象可能与研究材料本身所含成分差异有关。

本研究得出嘉宝果嫩叶乙酸乙酯及正丁醇部位抗氧化活性最强且两者相差不大，但远高于其他极性部位，可见嫩叶中大多数抗氧化活性成分与乙酸乙酯及正丁醇的极性接近。试验结果显示嘉宝果嫩叶的总多酚成分主要集中于乙酸乙酯相与正丁醇相，约占总含量的71.39%，其次为水相，占18.71%;总黄酮则相对较均匀地分布在乙酸乙酯相、正丁醇相及水相，分别占总含量的32.48%、31.46%、27.20%，由此可见抗氧化活性的大小与总多酚含量关系密切。该研究结果与覆盆子相关报道[20]较一致，即覆盆子醇提物及其不同极性部位的总酚含量与抗氧化能力间存在较好的正相关性，总酚含量越高，提取物的抗氧化活性就越强。但是，本研究结果也表明抗氧化能力并不完全取决于总多酚含量，例如，嘉宝果嫩叶乙酸乙酯相的总多酚含量显著高于正丁醇相，但乙酸乙酯相对DPPH自由基的清除能力低于正丁醇相，该研究结果与菠萝皮渣[23]报道相似，菠萝皮渣正丁醇相多酚含量（44.18 mg/mL）高于石油醚相（12.27 mg/mL），但是正丁醇相对DPPH·和·OH的清除能力却明显低于石油醚相，表明醇提物不同极性部位抗氧化活性除与其多酚含量有关外，还与其他成分有关。

嘉宝果嫩叶不同极性部位对α葡萄糖苷酶的抑制活性以乙酸乙酯相和正丁醇相的抑制作用最强，水相次之，石油醚相及二氯甲烷相最弱，该结果与抗氧化活性类似，但与抗氧化活性存在差异的是嘉宝果嫩叶乙酸乙酯相与正丁醇相对2种不同来源的α葡萄糖苷酶的抑制作用表现为乙酸乙酯相抑制活性明显高于正丁醇相，该结果与对雪菊[24]、白花丹根[25]的研究结果一致，但甘草[26]中酶活性抑制率大小依次为乙酸乙酯相（83.2%）>石油醚相（68.93%）>正丁醇相（32.17%）>水相（10.79%），且酶抑制活性最强的活性成分为甘草黄酮和甘草次酸。可见不同植物中有效活性成分复杂多样。本研究结果表明抑制α葡萄糖苷酶的有效活性成分最多集中于乙酸乙酯相，其次为正丁醇相，该活性可能与总多酚及总黄酮含量均有关。因此，乙酸乙酯相及正丁醇相可以作為嘉宝果叶活性成分的主要极性部位进行活性成分分离、结构鉴定及活性跟踪等深入研究。

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