红豆杉中紫杉烷类成分含量测定方法研究进展

2017-03-21冯学花曹殿洁谢伟孟迪

长江大学学报(自科版) 2017年18期

关键词：巴卡紫杉红豆杉

冯学花，曹殿洁，谢伟，孟迪

(安徽新华学院药学院，安徽合肥 230088)

红豆杉中紫杉烷类成分含量测定方法研究进展

冯学花，曹殿洁，谢伟，孟迪

(安徽新华学院药学院，安徽合肥 230088)

紫杉醇是红豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)中一种优良的天然抗癌成分，但因其在红豆杉中的含量极少而不能得到广泛推广应用。紫杉烷类化合物作为合成紫杉醇的前体，近年来备受关注。对紫杉烷类化合物含量测定方法的研究进展进行了综述。

红豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)；紫杉烷类；含量测定方法；研究进展

红豆杉(Taxuschinensis(Pilger)Rehd.)是远古第四纪冰川遗留下来的古老植物，有着250万年的悠久历史，为国家一级重点保护植物，自然分布极少。红豆杉树全身是宝，其茎、叶、枝、果实、心木、皮均可入药，因此又被称为“黄金树”[1～3]。红豆杉主要含有紫杉烷类、黄酮类、倍半萜等多种化学成分，其中紫杉烷类包括紫杉醇及2种重要前体巴卡亭Ⅲ(BⅢ)和10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)，紫杉醇是近40a来发现的存在于红豆杉中的一种有效天然抗癌活性成分，临床上已被成功应用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的治疗。由于紫杉醇在红豆杉中的含量甚微，因此作为紫杉醇的合成前体紫杉烷类化合物具有广阔的研究前景[4]。为此，笔者对紫杉烷类化合物含量测定方法研究进展进行了综述，以为紫杉烷类化合物的进一步开发和利用提供参考。

1 红豆杉中紫杉醇含量的测定

1.1高效液相色谱法

何法霖等[5]建立了一种高效液相色谱法测定加拿大红豆杉浸膏中紫杉醇含量的方法，实验条件选择PFP柱(4.6mm×250mm，5μm)，甲醇-乙腈-水(10∶42∶48)为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长227nm，室温条件，进样5μL，图谱采集时间45min。方法中考察了检测波长、流动相组成和提取方法3个因素，选择了多种不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水和乙腈-水等流动相体系，结果以甲醇-乙腈-水(10∶42∶48)等效洗脱的分离效果最佳。通过在190～550nm波长范围内进行扫描，发现紫杉醇在227nm处有最大吸收，因此确定227nm作为检测波长。蔡玉梅等[6]采用HPLC法测定不同年龄曼地亚红豆杉根中紫杉醇的含量，实验系统条件设置为AngilentHypersilODS2柱(4.6mm×250mm，5μm)，甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)为流动相，柱温为30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为227nm，进样量10μL。实验结果表明紫杉醇和三尖杉宁碱结构比较相近，较难分离，对比发现以HypersilODS2柱效果为好，含量测定方法准确可行，重复性好，可以测定不同年龄曼地亚红豆杉根中紫杉醇的含量。

高效液相色谱法(HPLC)测定紫杉醇及其他紫杉烷类化合物的含量，具有高效能、高速速的分离检测特点，其分析过程中的关键环节是流动相组成和比例、洗脱方式等，这种方法因具有灵敏度高、适用范围广、分析速度快且不破坏样品等优势在含量分离分析方面得到广泛应用。

1.2固相萃取-反相高效液相色谱法

李俭等[7]采用HPLC内标法测定了南方红豆杉不同部位中紫杉醇的含量。实验系统条件设置为：甲醇-乙腈-水(22∶36∶42)为流动相，流量为1.0mL/min，230nm为检测波长，进样10μL，图谱采集时间为10min。实验采取一次性固相萃取柱纯化，配合使用标准溶液过C18小柱,进样量1mL，分别用10mL水、2mL50%甲醇溶液连续洗脱5次，继续用1.5mL的80%甲醇溶液连续洗脱5次，分别收集各次洗脱液进行色谱分析。结果表明，固相萃取相对于液-液萃取法、硅胶柱层析法或硅胶薄板层析法等方法效果较好，能在不洗脱紫杉醇的前提下最大限度地洗脱杂质而后将紫杉醇完全洗脱。

2 红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)含量的测定

紫杉烷类化合物为合成紫杉醇或其类似物的前体，能合成比自身抗癌活性更高的物质。紫杉烷萜类化合物主要存在于红豆杉树枝、叶等部位中，其含量可达紫杉醇的数十倍之多，其中，10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)就是一种常见的紫杉烷类化合物，可用于合成比紫杉醇等具有更高抗癌活性的紫杉醇类似物[7]。因此，对红豆杉资源中紫杉烷类物质含量测定方法进行研究具有重要意义。

2.1高效液相色谱法

胡杰等[8]采用HPLC法测定了东北红豆杉枝叶提取物中10-DABⅢ的含量。色谱条件为：以C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)为色谱柱，甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)为流动相，检测波长选择234nm，检测温度32℃，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。实验中设计了多种流动相体系，通过对比不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等效洗脱及梯度洗脱的流动体系条件下的检测结果，确定了甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)作为流动相，因其分离效果和重现性相对较高。该实验结果表明用该法测定10-DABⅢ的含量结果准确，可以用于监控质量或为新药的研究开发提供依据。安春志等[9]应用HPLC内标法测定了云南红豆杉枝叶提取物中10-DABⅢ的含量。色谱条件选择C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，甲醇-乙腈-水(5∶35∶60)为流动相，检测波长227nm。实验通过对多种流动相体系如不同配比的甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等效洗脱及梯度洗脱进行对比发现大多液相条件在4min出峰，而甲醇-乙腈-水(5∶35∶60)在13min左右出峰。另外，为降低成本和减少毒性，采用乙醇代替甲醇，效果良好。通过实验发现，高效液相色谱法可靠简便、重现性好、灵敏度高、专属性强，具有较高实用价值，对建立红豆杉提取物中紫杉烷萜类10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的指纹图谱和质量控制较为实用。

2.2固相萃取-高效液相色谱(SPE-HPLC)法

孔繁晟[10]采用固相萃取-高效液相色谱(SPE-HPLC)法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。实验及色谱条件为：固相萃取柱为Agilent ODS C18500mg/3mL，色谱柱为Agilentzorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水-乙腈( 35∶55∶10)，流速设置为1.0mL/min，检测波长227nm，柱温30℃。固相柱的洗脱溶液分别是0.01mol/L的乙酸铵、40%的甲醇乙酸铵溶液、80%的甲醇乙酸铵溶液40mL淋洗，最后用甲醇溶液淋洗固相柱。实验发现在1.6～8.0μg/mL范围内，10-DABⅢ的线性关系良好，此法可用于红豆杉枝叶中10-DABⅢ的含量测定。根据实验结果发现用固相柱对样品进行处理后再进行含量测定，既可以去除杂质又能有效保护色谱柱，方法稳定，结果准确可靠。

2.3反相高效液相色谱法(RP-HPLC)

甄铧[11]采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定了欧洲红豆杉中10-DABⅢ的含量。色谱条件为：色谱柱为Shim-Pack VP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-水，梯度洗脱(0→27min，乙腈的体积分数为20%→50%)；流速1.0mL/min；柱温40℃；检测波长232nm；进样量20μL。理论塔板数按10-DABⅢ峰计算不低于10000。实验中10-DABⅢ在乙腈-水中易溶，进行HPLC分析时，10-DABⅢ保留时间随乙腈的比例升高而缩短，因此实验通过调整乙腈的比例来改变10-DABⅢ的分离度。实验在制样方法和用硅胶柱层析中有针对性地对10-DABⅢ粗分离进行了研究，该方法具有过程简单、续制样、效率高、重现性好、成本低、低检出等优点，简化HPLC分析的前处理，能得到满意的效果。甄桦等[12]采用反相高效液相色谱法测定曼地亚红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量，色谱条件为：色谱柱为Shim-Pack VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-水(45∶55)；流速1.0mL/min；柱温40℃；进样量20μL；检测波长232nm；灵敏度0.16AUFS。在该色谱条件下，10-DABⅢ对照品保留时间为10min，理论塔板数12918。10-DABⅢ的色谱峰与邻近峰的分离度大于1.5，分离度良好。实验过程简单，所需条件容易实现，所以是测定10-DABⅢ含量的方法之一。

2.4超高液相色谱法(UPLC)

张静等[13]采用UPLC法同时测定曼地亚红豆杉中10-DABⅢ、三尖杉宁碱和紫杉醇的含量，并对不同采收期、不同部位曼地亚红豆杉中这3种有效成分的含量变化规律进行了研究分析。色谱条件为：色谱柱为AC-QUITY UPLC BEH Shield RP 18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相为水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～8min，78%A；8～11min，78%A→65%A；11～44min，65%A)；流速0.2mL/min，检测波长227nm，柱温25℃；进样量1μL。该色谱条件下，各相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，分离度良好，拖尾因子在0.95～1.05之间，理论塔板数均大于30000，能够满足分析需求。实验结果表明，该法可以用来测定紫杉烷类含量。

3 结语

SPE-HPLC法、RP-HPLC法、UPLC法等是近年来紫杉烷类化合物含量测定的常用方法，这些方法各有特点。不难发现，紫杉烷类化合物的测定方法以高效液相色谱法为多，高效液相色谱法具有高效能、高速度、高灵敏度、重现性好等优点。所用流动相中多含有乙腈和水，分离效果较好，采用乙腈系统流动相时，柱压较低，洗脱能力较强，保留时间适中，峰形对称性好。由于紫杉醇药材的昂贵性以及特殊的生物活性，在医药领域越来越多地受到重视，而发展快速、简便、灵敏、准确的活性物质含量测定方法则是研究开发和应用紫杉醇的基础。

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[3]唐俐.紫杉醇周疗治疗复发性或难治性卵巢上皮癌的临床观察[J].中国现代医药杂志，2011，(1):88～89.

[4]徐广侠,刘格戈.紫杉醇治疗晚期胃癌临床疗效观察[J].中国卫生产业，2014，(34):114～115.

[5]何法霖,卢建伟,赵锐，等.HPLC测定加拿大红豆杉浸膏中紫杉醇的含量[J].中国中药杂志，2007，32(8):753～754.

[6]蔡玉梅，李清兰，林茂帆，等.HPLC法测定不同年龄曼地亚红豆杉根中紫杉醇的含量[J].安徽农业科学，2010，(28):15600～15601.

[7]李俭，刘宇，时美慧，等.HPLC内标法测定南方红豆杉不同部位中紫杉醇的含量[J].军事医学，2011，(8):624～626.

[8]胡杰，蒋剑平，熊耀康，等.HPLC、UPLC测定南方红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的含量[J].中国中医药科技，2016，(2):168～169，171.

[9]安春志，罗佳波，刘莉，等.HPLC法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量[J].广州医药，2006，37(5):47～49.

[10]孔繁晟.云南红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量的固相萃取-高效液相色谱法测定[J].时珍国医国药，2010，21(6):1426～1427.

[11]甄铧.RP-HPLC法测定欧洲红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的含量[J].中国药房，2009，20(27):2125～2126.

[12]甄铧,蒲尚饶,张学毅.反相高效液相色谱法测定曼地亚红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量的研究[J].药物分析杂志，2008，28(3):358～361.