经血宁胶囊凝血作用的药效学研究

唐耀辉　杨捷　谢金鲜

[摘要] 目的 探讨经血宁胶囊的凝血作用及其机制，为其临床应用提供依据。 方法 采用随机数字表法将60只实验小鼠及30只新西兰兔随机分为5组，即空白组、阳性组、经血宁胶囊高剂量组（JXN-H组）、中剂量组（JXN-M组）、低剂量组（JXN-L组），连续灌胃给药1周，每天给药1次。末次给药后1 h，测定实验小鼠凝血时间（CT）、新西兰兔凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（FIB）和血浆复钙时间（PRT）。 结果 经血宁胶囊能显著缩短小鼠凝血时间，JXN-H组、JXN-M组与空白组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；经血宁胶囊各给药组显著缩短家兔PT、APTT、TT、PRT，提高血浆FIB含量，与空白组比较差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 经血宁胶囊具有显著的凝血作用。

[关键词] 经血宁胶囊；凝血作用；药效学

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）01（c）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the coagulation function and mechanism of Jingxuening Capsules， and to provide scientific basis for its clinical utility. Methods Sixty experimental mice and 30 New Zealand rabbits were randomly divided into five groups by random number table， namely blank control group， positive control group， high dose of Jingxuening Capsules group （JXN-H group）， middle dose group （JXN-M group） and low dose group （JXN-L group）. Intragastric administration for one weeks， one hour after the last administration， clotting time （CT）， prothrombin time （PT）， activated partial thromboplastin time （APTT）， thrombin time （TT）， fibrinogen （FIB） and plasma recalcification time （PRT） of each group were tested. Results Jingxuening Capsules could significantly shorten the clotting time in mice， compared with blank group， JXN-H group and JXN-M group showed significant differences （P < 0.05）. All medication administration groups of Jingxuening Capsules could shorten CT， PT， APTT， TT， PRT in New Zealand rabbits， and increase the content of FIB significantly （P < 0.05 or P < 0.01） compared with the blank group. Conclusion Jingxuening Capsules have marked coagulation function in vivo.

[Key words] Jingxuening Capsules； Coagulation function； Pharmacodynamics

经血宁胶囊是由白背叶和扶芳藤的提取成分组成。白背叶（Mallotus apelta）为大戟科野桐属植物的干燥叶，其性平、微苦、澀，归肝、脾经，具清热解毒、祛湿止血之功，可用于慢性肝炎、白带、湿疹、跌打损伤、外伤出血等[1]。扶芳藤（Enonymus fortunei）系卫矛科卫矛属植物，文献记载其具有缓解腰肌劳损、补肾强筋、安胎、止血消癖等功效[2]。本研究通过观察小鼠凝血时间、家兔凝血四项及血浆复钙时间在经血宁胶囊干预后的变化，研究经血宁胶囊的凝血作用，并探讨其可能的作用机制，为其进一步开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

经血宁胶囊由广西中医学院制药厂科研所提供（批号：20110402），所需药材白背叶及扶芳藤由广西中医药大学赛恩斯新医药学院苑敏教授鉴定，经鉴定分别为大戟科野桐属植物白背叶[Mallotus apelta（Lour.）Muell.-Arg.]的叶和卫矛科卫矛属常绿藤本灌木扶芳藤[Euonymus fortunei（Turcz.）Hand.-Mazz]的带叶茎枝，药材性状均符合2015年版《中国药典》一部规定。

1.2 试剂

凝血酶原试剂盒（北京莱博生物实验材料研究所，批号20105090）；活化部分凝血活酶时间（APTT）试剂盒（北京莱博生物实验材料研究所，批号20111021）；凝血酶时间（TT）试剂盒（北京莱博生物实验材料研究所，批号20111027）；纤维蛋白原（FIB）试剂盒（北京莱博生物实验材料研究所，批号20110131）；氯化钙（北京莱博生物实验材料研究所，批号20111013）；枸橼酸钠（广东达濠精细化学品公司，批号20110323）；云南白药（云南白药集团股份有限公司，批号20110629）；其余试剂为国产分析纯。

1.3 实验动物

SPF级5周龄昆明种小鼠60只，雌雄不拘，体重18～22 g，由广西医科大学动物中心提供，使用许可证号：SCXK（桂）2011-0002；4月龄新西兰兔30只，雌雄不拘，体重1.7～2.0 kg，由广西中医药大学实验动物中心提供，使用许可证号SYXK（桂）2003-0001；实验动物适应性饲养3 d，自由摄食饮水，动物房温度（24±2）℃，相对湿度（50±10）%，光照循环为12 h明/12 h暗。

1.4 实验仪器

Sysn ECA-150型全自动血液凝固仪（日本东亚医用电子仪器有限公司）；Sysnex KX-21型血细胞分析仪（日本东亚医用电子仪器有限公司）；TU-1901型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；万分之一电子天平，型号EL-204，（梅特勒-托利多仪器有限公司）；80-2台式低速离心机（上海手术器械厂）；微量移液器（大龙医疗设备有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 经血宁胶囊对凝血时间（CT）的影响（毛细血管法）[3] 将60只健康昆明种实验小鼠随机分为空白组、阳性组、经血宁胶囊高剂量组（JXN-H组）、经血宁胶囊中剂量组（JXN-M组）和经血宁胶囊低剂量组（JXN-L组）5个组，每组12只。空白组给予等容积生理盐水，阳性组给予云南白药1 g/kg，JXN-H组、JXN-M组、JXN-L组剂量分别为18、9、4.5 g/kg，灌胃给药，给药容量为0.2 mL/10 g。连续给药1周，每天给药1次。末次给药后1 h测定CT。各组小鼠分别于用药后1 h测定CT。实验时取内径为8 mm毛细玻璃管，刺入小鼠眼内眦球后静脉丛采血，自血液进入毛细玻璃管开始计时，30 s折断玻璃管1次，观察折断玻璃管处有无血丝出现，以后每隔15 s折断玻璃管1次，直至玻璃管内出现血丝即为CT。

1.5.2 经血宁胶囊对家兔凝血四项的影响 将30只健康新西兰兔随机分为空白组、阳性组、JXN-H组、JXN-M组和JXN-L组5个组，每组6只。空白组给予等容积生理盐水，阳性组给予云南白药3 g/kg，JXN-H组、JXN-M组、JXN-L组剂量分别为18、9、4.5 g/kg，灌胃给药，给药容量为10 mL/kg。连续给药1周，每天给药1次。末次给药后1 h，用一次性采血针穿刺兔耳中动脉，采血置于含有枸橼酸钠抗凝剂的负压试管中，以3000 r/min（离心半径5 cm），离心15 min去除血小板，分离血浆，采用全自动血液凝固仪檢测凝血酶原时间（PT）、APTT、TT、FIB含量。

1.5.3 经血宁胶囊对新西兰兔血浆复钙时间（PRT）的影响 动物给药及分组同实验“1.5.2”。①血浆制备：用一次性采血针穿刺兔耳中动脉，采血置于含有0.2 mL 109 mmol/L枸橼酸钠抗凝剂的负压试管中，混匀后以1000 r/min（离心半径5 cm），离心10 min，分离血浆备用。②PRT测定：取试管3支，每管加入混合血浆和生理盐水各0.1 mL，混匀后，置入37℃水浴中预热1 min。然后加入0.1 mL已温育至37℃的氯化钙溶液。混匀后再放入37℃水浴中，立即启动秒表计时并不停地在水浴箱中倾斜试管混合，见有纤维蛋白丝出现，准确记录3管凝固时间均值，即为PRT。

1.6 统计学方法

采用统计学软件SPSS 17.0进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间两两比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 经血宁胶囊对凝血时间的影响

云南白药与经血宁胶囊均能缩短小鼠CT，阳性组、JXN-H组、JXN-M组与空白组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；且经血宁胶囊凝血作用随剂量的增加而加强，呈现明显的量-效依赖关系。见表1。

2.2 经血宁胶囊对家兔凝血四项的影响

与空白组比较，JXN-H组、JXN-M组、JXN-L组和阳性组家兔PT、APTT和TT明显缩短，血浆FIB明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

2.3 经血宁胶囊对家兔血浆复钙时间的影响

与空白组比较，JXN-H组、JXN-M组、JXN-L组和阳性组均能明显缩短家兔血浆复钙时间，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表3。

3 讨论

止血是血液重要的生理功能之一，血液存在功能对立的凝血系统和抗凝系统，他们通过各种凝血因子（因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ等）的调节保持着动态平衡[4-6]。受损血管的局部凝血过程分为4个短暂而又相互交叠的阶段。首先，由于神经源性作用及内皮源性收缩因子（如内皮素）的分泌，导致局部血管收缩，这被称为初级凝血[7]。在这一阶段，血小板活化，黏附到暴露的内皮下基质上，并聚集其他的血小板，从而使更多的血小板黏附到内皮下基质上，这一阶段以最终形成初级凝血栓子而告终[8-10]。次级止血过程中，也就是所谓的凝血级联反应，活化的内皮细胞及其周边细胞表达了一种膜结合的促凝因子，它能与凝血因子Ⅶ形成复合体，以启动后继的凝血级联反应，这一反应的最终目的是激活关键酶——凝血酶[11]。凝血酶在凝血过程中发挥两个重要作用：①使可溶性FIB转变为不可溶性纤维蛋白多聚体，从而形成血液栓块；②诱导聚集更多的血小板并将其活化。目前有研究表明，次级止血过程中纤维蛋白多聚体的形成与初级凝血过程中血小板栓块的形成是相互促进的，而且存在短暂的交叠过程。最后一个阶段，血小板聚集与纤维蛋白多聚体最终形成了牢固而永久的栓块[12]。

血液离体后与异物表面接触，凝血过程启动，参与凝血的因子被激活，最后使FIB转变为纤维蛋白而血液凝固，其中所需时间被称为CT，绝大多数情况下指的是内源性凝血活酶生成所需的时间，凝血因子Ⅷ、Ⅳ、Ⅺ对CT长短发挥着重要作用[13-15]；凝血过程第2阶段，在活化的因子Ⅴ、Ⅹ、PF3及钙等参与下，凝血酶原（因子Ⅱ）转变为凝血酶（因子Ⅱa）。在被检血浆中加入适量的钙，测定血浆凝固即为PT，是用于筛选检测外源凝血系统因子Ⅶ、Ⅴ、Ⅹ和相关因子的抑制物的试验[16-17]；APTT的测定反映了Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ等内源凝血途径因子的活性，是内源性凝血系统较敏感和常用的筛选方法[18]；而无论是外源性途径还是内源性途径最终都汇集在Ⅹ因子的活化反应上，活化的Ⅹ因子联合Ⅴ因子，将凝血酶原（因子Ⅱ）水解切割成凝血酶，凝血酶再将可溶性血浆纤FIB转化为纤维蛋白，从而形成不可溶的纤维多聚体，故TT的测定是检测凝血、抗凝及纤维蛋白溶解系统功能的一个重要步骤[19]；FIB由α、β、γ三对不同多肽链所组成，凝血酶水解后激活FIB，α链与β链分别释放出A肽与B肽，使之转变为纤维蛋白单体。在此过程中，由于释放了酸性多肽，负电性降低，单体易于聚合成纤维蛋白多聚体。进一步在Ca2+与活化的Ⅷ因子作用下，单体之间以共价键相连，则变成稳定的不溶性纤维蛋白凝块，完成凝血过程[20-21]。

经血宁胶囊中的两种药材是传统的止血中药，药用历史悠久，历代本草对它的功效均有论述。现已知有两条凝血通路。APTT时间延长而PT正常时，认为是内源性凝血通路障碍。因为APTT试验的内容物（除白陶土以外）对于血浆来说均是内源性的；而PT延长，APTT正常的话，认为是外源性凝血通路障碍，因为凝血激酶对于血浆来说是外源性物质[22]。本实验通过初步的凝血研究，从小鼠CT测定结果来看，经血宁胶囊高、中、低剂量均可不同程度地缩短小鼠CT，体现其具有良好的凝血作用，且其作用随剂量的增加而加强，呈现明显的量-效依赖关系。从家兔凝血四项测定结果来看，经血宁胶囊高、中、低剂量均能有效缩短家兔APPT、PT、TT，体现本品参与了凝血的各个阶段，同时影响内源性和外源性凝血系统而起到促凝作用，而使FIB含量增加则提示其凝血作用可能与影响纤维蛋白溶解系统有关。

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（收稿日期：2016-10-11 本文编辑：张瑜杰）