慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因检测及其临床意义*

郭晓波,姚 静,杨 乐△,蔺 京,

1.西安交通大学医学部附属西安市中心医院(西安710003)，2.西安交通大学第二附属医院(西安710004)

慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因检测及其临床意义*

郭晓波1,姚 静2,杨 乐1△,蔺 京1,

1.西安交通大学医学部附属西安市中心医院(西安710003)，2.西安交通大学第二附属医院(西安710004)

目的：探讨BCR-ABL融合基因与慢性粒细胞白血病(CML)的相关性。方法：利用实时荧光定量PCR检测168例CML患者体内BCR-ABL含量，并与113例非CML患者作为对照组进行比对，分析BCR-ABL基因与CML的相关性。结果：168例CML患者BCR-ABL检测阳性156例(92.9%)，阴性12例(7.1%)。对照组113例非MCL者BCR-ABL阳性3例(2.7%)，BCR-ABL阴性110例(97.3%)。CML患者BCR-ABL阳性率明显高于正常对照组，差异有统计学意义。其中，BCR-ABL阳性组男性高于女性，差异有统计学意义；阳性组的平均年龄和白细胞平均数均高于阴性组，差异有统计学意义。结论：BCR-ABL是诊断CML重要辅助检查，与CML之间存在相关性。

慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)是一种造血干细胞恶性疾病，患者外周血白细胞数多明显增加，重度贫血或血小板数持续增高或持续下降。其分子生物学特征是通过FISH、RT-PCR术或Southern blot方法可以检测出BCR-ABL融合基因突变，该基因编码的融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，从而引发大量异常细胞的恶性增殖[1-2]。BCR-ABL融合基因存在于95%以上的慢性粒细胞白血病[3]。BCR-ABL融合基因的表达水平反应了患者体内白血病细胞的负荷量，精确检测BCR-ABL融合基因表达水平，对白血病的临床分型诊断、个体化治疗方案的制定、治疗效果检测、缓解后复发风险的估计和预防、干细胞移植后残留细胞的检测和早期干预治疗等方面具有重要作用。本文对CML患者进行BCR-ABL融合基因检测，分析其与CML的相关性，为以后对CML患者研究提供分子学依据。

资料和方法

1 一般资料 所有CML病例均为我院2012年8月至2014年6月住院病人，均经骨髓涂片和活检诊断证实，其中男85例,女83例，年龄14～70岁，中位年龄55岁。对照组113例,男60例，女53例,均为非MCL患者，年龄20～65岁,中位年龄39岁。所有临床资料及标本均在取得患者知情同意后采集。

2 仪器与试剂 荧光定量PCR仪采用美国伯乐CFX96，RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒天根生化科技有限公司，融合基因试剂盒(BCR-ABL)购自上海之江生物科技股份有限公司。

3 检测方法 抽取患者骨髓或者静脉血5.0ml加入装有EDTAK2作为抗凝剂的试管中，混匀，将标本通过使用红细胞裂解液除去血液(骨髓)中的红细胞，获得白细胞；用RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒从上步获得的白细胞沉淀中提取RNA。将核酸荧光PCR混合液分别与等人份的RT-PCR酶混合，震荡混匀数秒，3000r/min离心5s。将上述配制好的体系置于PCR管中，然后将提取好的RNA、DEPC-H2O、对照品、标准品分别加入对应管内。反应管置于荧光PCR仪上，设置循环参数：45℃×20 min→95℃×5 min，再按95 ℃×15s→58 ℃×30 s→72 ℃×45 s,循环45次；单点荧光检测在58℃。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。整个实验操作均严格按照操作规范进行，同时做内参，阳性和阴性对照，均在控。

4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件，计数资料以百分率表示，采用t检验和χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 部分标本实时荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线 见图1。

2 CML患者BCR-ABL突变情况 168例CML患者BCR-ABL阳性156例(92.9%)，BCR-ABL阴性12例(7.1%)。对照组113例非MCL者BCR-ABL阳性3例(2.7%)，BCR-ABL阴性110例(97.3%)。CML患者BCR-ABL阳性率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

Amplification为扩增曲线，Cycles为循环数，Log Scale为对数范围

表1 CML患者Real-time RT-PCR技术检测BCR-ABL突变率

注：与对照组突变率比较，*P<0.01

3 BCR-ABL阳性和阴性组在临床参数上的差异 BCR-ABL阳性组男性高于女性，差异有统计学意义(P<0.05)；阳性组的平均年龄和白细胞平均数均高于阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)。CML患者临床参数分析：CML患者临床参数包括确诊时血常规检查、年龄、性别，见表2。

表2 BCR-ABL阳性与阴性CML患者临床特点及血液学参数比较

注：与BCR-ABL阴性比较，*P<0.05，△P<0.01

讨 论

我国1986-1988年对22个省、市、自治区的流行病学调查表明，CML年发病率为0.36/10万，占白血病的第3位。各年龄段均可发病，发病率随年龄增长而明显增加，发病年龄五、六十岁。近年随着诊断技术的提高，诊断年龄有年轻化趋势，男性发病略高于女性。BCR-ABL融合基因存在于95%以上的慢性粒细胞白血病患者，是CML最重要特征性标志，是疾病状态的决定性因素，对CML的诊断具有重要意义。因此，对CML与BCR-ABL融合基因之间相关性的研究也越来越重要[4]。

BCR基因由于易位与ABL基因形成BCR-ABL融合基因，该基因的表达激活了酪氨酸蛋白激酶，扰乱了正常的信号传导途径，抑制了凋亡的发生。BCR基因由于断裂点不同分为:主要(major bcr，M-bcr)、次要(minor bcr，m-bcr)和μ(μ-bcr)[5-6]。M-bcr和m-bcr，俩者可以单独存在或同时存在，见于绝大多数的CML；少数患者表达m-bcr，多见于ALL；更为少见的CML患者表达μ-bcr。因此，对于CML患者需要进行BCR-ABL融合基因的全面筛查，以免漏诊。

基因检测对临床的诊断及治疗发挥着越来越重要的作用，应用实时荧光定量PCR技术，检测BCR-ABL融合基因的表达情况，敏感性好，稳定性高，可操作性强，对临床检验具有普遍意义，值得推广。冯术青等[7]研究证明实时荧光定量PCR是评估CML患者治疗后复发情况的良好方法，通过BCR-ABL水平的动态监测，可筛选出高复发风险的患者，配合早期干预性治疗措施可以提高患者无病生存率。本研究结果表明CML患者BCR-ABL阳性率为92.9%，明显高于对照组，差异有统计学意义，从而提示对CML患者进行BCR-ABL检测有重要的临床价值，可为患者的诊断判断提供一定帮助。本研究结果略低于其他研究者结果，可能与标本数量少，目前RNA的提取、标准品、引物等没有统一的标准有关，所以才导致各实验室之间的结果会有一定的差异。其中，BCR-ABL阳性组男性高于女性，阳性组的平均年龄和白细胞平均数均高于阴性组，差异有统计学意义，可为以后CML的深入研究进一步提供帮助。对于存在BCR-ABL阳性的患者给予早期的干预治疗，对疾病获得良好的结果有重要意义。

BCR-ABL融合基因可结合临床表现、外周血、骨髓形态、骨髓病理、染色体等检查，将CML分为慢性期(CP)、加速期(AP)、急变期(BP)。同时，在监测分子靶向治疗疗效和异基因造血干细胞移植疗效方面也有重要的作用。许兰平等[8]分析64例造血干细胞移植的CML患者，根据BCR-ABL监测结果，在移植后期进行了干预治疗，结果显示伊马替尼组、免疫调节治疗组、联合治疗组患者BCR-ABL融合基因转阴率分别为86.0%、90.0%、83.9%。

[1] 黄 丹,高贝贝,李 莉,等.慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因实时定量检测平台的建立[J].大连医科大学学报,2014,36(1):13-17.

[2] Gallipoli P, Abraham SA, Holyke TL. Hurdles toward a cure for CML: the CML stem cell [J]. Hematol Oncol Clin North A , 2011, 259(5): 951-966.

[3] 张 艾，胡 群，张柳清，等.bcr-abl融合基因阳性儿童急性淋巴细胞白血病临床分析[J].白血病·淋巴瘤，2014,23(3):160-162.

[4] Wang QF. MLL fusion proteins preferentially regulate a subset of wild-type MLL target fenes in the leukemic genome [J]. Blood, 2011, 117(25): 6895-6905.

[5] 蔡文治，何雪峰，陈苏宁，等.Ph/BCR-ABL阳性急性髓系白血病12例临床及实验室特征分析[J].中华血液学杂志，2015,36(5):398-402.

[6] 桂晓敏，潘金兰，仇惠英，等.伴不典型BCR-ABL融合基因的慢性髓性白血病的临床和实验研究[J].中华血液学杂志，2014,35(3):210-214.

[7] 冯术青，宋旭东，高 峰，等.实时定量PCR技术监测BCR-ABL水平在异基因造血干细胞移植治疗慢性粒细胞白血病中的应用[J].中华移植杂志，2014,8(4)：196-200.

[8] 许兰平，刘代红，刘开彦，等.慢性粒细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后不同干预方案疗效的比较研究[J].中华血液学杂志，2010,31(11)：758-762.

(收稿：2015-12-15)

*陕西省自然科学研究计划项目(2014JM2-8182)

白血病，粒细胞，慢性/免疫学 @BCR-ABL基因 基因融合 聚合酶链式反应

R733

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.039

△通讯作者